基因文库的构建.docxVIP

基因组DNA文库构建的基本流程口期：2013-03-07来源：网络标签：载体DNA文库文库构建摘要：基因组DNA文库构建的基本流程是什么？基因组DNA文库构建有哪些步骤？基因组DNA文库构建有哪些实验必备技巧？基因组DNA文库构建有哪些注意事项？相信一下内容给你个清楚的解答。 基因组DNA文库有十分广泛的用途，如用于分析、分离特定的基因片段，用以基因表达调控、人类及动植物基因组工程的研究。通常情况下，基因组文库构建的基本流程可以归为4大步骤：分离基因组DNA、对基因组DNA作相关的处理、将基因组DNA片段连接入载体、将重组载体转入宿主细胞。 一、分离基因组DNA（gDNA）毫无疑问，优质的基因组DNA对于基因组文库构建是至关重要的。研究者需要查阅文献,通过经验来选择合适的基因组DNA分离方法，在分离过程中保证DNA不被过度剪切或降解，同时也要尽量保证DNA的纯度。 二、处理基因组DNA根据研究目的，研究者需要选择合适的载体。不同的载体对基因组DNA的长度有不同的要求，研究者必须选择合适长度的基因组DNA来构建基因组文库。比如，对于黏粒载体（比如Epicntre的pCCIFOSTM、pEpiFOSTM-5、pWEB-TNCTM、pWEBTM）,合适的片段长度大约为40kb;对于BAC载体（比如EpICEnUe的pIndigoBAC-5、pCCIBACTM）,平均来说，合适的片段长度为120kb-300kbo构建黏粒基因组DNA文库，研究者需要将基因组DNA用注射器抽打来随机剪切DNA;接着用末端修复酶修复DNA,可以提高DNA连接入载体的效率;然后通过脉冲场电泳或者普通电泳来找到40kb左右的dna片段，随后使用EpicentreGELase胶回收试剂盒回收DNA。构建BAC基因组DNA文库，研究者需要将基因组DNA用限制性内切酶（常用EcoRLBaniHI或者HindIII）来消化基因组DNA,然后通过脉冲场电泳找到合适长度的DNA片段（比如100kb-150kb）,随后透析回收DNA。 需要注意： （1）电泳时，要选用合适的DNALadder,以保证电泳后可?以准确定位所需分子量的DNA。用Epicentre试剂盒构建黏粒文库时,就可以直接采用文库试剂盒内的ControlInsertDNA来做marker,既方便又准确。 （2）电泳以后，应该避免用紫外光照射目标DNA,紫外光照射DNA会显著降低克隆效率。解决方法：把marker所在的部分凝胶切下，在紫外灯下做好记号，然后以此为参考定位所需的片段。 （3）回收DNA的时候，应该要避免过度离心，以防止.DNA被剪切，降低文库质量。 三、载体的选择目前，常用的基因组文库载体有黏粒载体、P1噬菌体载体、PAC载体（P1人工染色体）、BAC载体（细菌人工染色体）和YAC载体（酵母人工染色体）。选用何种载体可以参考如下几个因素： 目标区域的大小如果基因组的目标区域很小（小于50kb）,那么可以选择黏粒载体甚至是人噬菌体载体。利用现有的商品化的黏粒载体、高效率的包装混合物和合适的大肠杆菌菌株，研究者可以方便的构建黏粒载体文库。 如果基因组的目标区域比较大，那么Pl、PAC或者BAC就比较合适了。P1操作比较困难,PAC相对简便。BAC载体也是很好的选择，研究者可以利用现有的成熟产品来构建BAC文库，比如EPICENTRE公司的一系列BAC载体及配套试剂盒。 如果目标区域非常大(大于250kb),那么YAC载体就是首选了。不过，应用YAC载体来构建基因组文库，操作非常繁琐困难，一般由专门的公司来完成。 表1各种载体的比较载体容量(kb)宿主导入细胞方式黏粒30-45大肠杆菌转导P170-100大肠杆菌转导PAC130-150大肠杆菌电转BAC120-300大肠杆菌电转YAC250-400酵母转化筛选文库的难易程度黏粒载体一般使用传统的滤膜影印杂交来筛选，但是这种方法对于构建区域图谱及叠连群来说既费力又浪费。大容量载体文库，如Pl、PAC、BAC、YAC,以二维阵列保存，既可以用传统的单拷贝的探针杂交法筛选，又可以用PCR进行多克隆的群体筛选。而且，使用高容量载体构建文库，可以减少染色体步查的步骤。 载体拷贝数的考虑当把大片段DNA片段克隆到高拷贝的载体时，克隆DNA会发生重组，从而影响克隆序列的保真性和稳定性;而单拷贝载体的低产量DNA是高通量分析的瓶颈。这个矛盾常常困扰着研究者。 而EPICENTRE怎CopyControlTM克隆系统是对这些困难的最好的解决方案。CopyControlTM技术整合了单拷贝载体与多拷贝载体的优点°单拷贝载体能提高插入片段的稳定性，而且拷贝载体能在诱导剂的作用下，即时扩增出高拷贝数的克隆而获得高产量的DNAo四、将基因组DNA片段连接入载体使用连接酶把上述