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电子显微镜免疫组织化学技术;第七章 电子显微镜免疫组织化学技术;一、 电子显微镜免疫组织化学技术慨述;（一）组织固定与取材 （二）免疫染色 （三）包埋 （四）对照试验;（一）组织固定与取材;PLP液中过碘酸能氧化糖类，使其产生醛基，再经赖氨酸作用，使新形成的醛基分子间和分子内相互连接，稳定组织抗原。但赖氨酸价格较贵，不如多聚甲醛—戊二醛固定液经济、简便、效果佳。在取材方面，免疫电镜技术较光镜免疫化学技术要求更迅速、精细。 ;（二）免疫染色;1．包埋前染色; 包埋前染色的组织，以中层较为理想。表层因受机械修整，结构往往保存不好，深层因抗体不能透入，免疫反应弱或无。在作超薄切片前应先切半薄切片，寻出免疫反应阳性部位。在HE或甲苯胺蓝染色的半薄切片上，免疫反应部位呈棕黄色。据此定位作超薄切片，可大大提高阳性反应检出率。为避免电镜铅、铀染色反应与免疫反应之间的混淆，可取相连续的超薄切片，分别以两个铜网捞取，其中之一进行染色观察，另一以铀单染色或不染色进行对照观察。 ;包埋前染色法的优点是： ①切片染色前不经过锇酸后固定、脱水及树脂包埋等过程，抗原未被破坏，易于获得良好的免疫反应。 ②可在免疫反应阳性部位定位作超薄切片，提高电镜下的检出率。特别适用于含抗原量较少的组织，但由于经过一系列的免疫染色步骤，常出现一定的超微结构损伤。;2．包埋后染色 ;②在载网染色过程中，铜网易与化学物质产生反应，故需选用镍网或金网。 ③在免疫组化处理的全过程中，应注意保持网面的湿润，网面干燥会影响抗体活性。 ;本法的优点是超微结构保存较好，方法简便，阳性结果有高度的可重复性，还能在同一超薄切片上进行多重免疫染色。但抗原活性在电镜生物样品处理过程中可能减弱甚至丧失；环氧树脂中的环氧基，在聚合过程中可能与组织成份发生反应而改变抗原性质；包埋在环氧树脂中的组织不易进行免疫反应等。;因此，免疫组化工作者曾试图以不同的方法，如，饱和苯溶液，无水酒精中NaOH饱和溶液或乙氧化钠溶液等以减少或去除包埋剂，取得不同程度的效果。为克服后一缺点，现普遍采用的是在进行免疫染色前，将载网超薄切片以H202液蚀刻数分钟，以去除四氧化锇和增强树脂的穿透性。 ;3．超薄冰冻切片 ;（三）包埋;1．树脂包埋 国内现普遍采用的是环氧树脂包埋法，可直接脱水后包埋，也可将小片组织或半薄切片贴在载片上，将充满环氧树脂的明胶囊倒置于切片上聚合、硬化，进行原位包埋。;2．低温包埋 常规树脂包埋由于需高温聚合等处理程序，组织抗原性可能全部或部分丢失。因此，在免疫电镜技术方面，国外不少实验室已开始采用低温技术如低温包埋和冰冻超薄切片等，后者需配备冰冻超薄切片机，且技术难度较大，不如低温包埋法易推广。低温包埋剂的研究开始于60年代，80年代免疫细胞化学技术在电镜水平上的广泛应用，为低温包埋剂的实验研究开辟了广阔的领域。; 国外已有较多的应用报道，国内一些实验室已开始摸索。作为低温包埋剂的多为乙烯系化合物如乙二醇甲基丙烯酸酯(Glycolmethacrylate，GMA)，Lowicryls，LR White和LR Gold等，目前国外生产厂家有Polysciences INC，Reichert-Jung和LKB等系列产品。现将常用的几种低温包埋剂及其应用简单介绍如下： ; （1）Lowicryls 是丙烯酸盐(acrylate)和甲基丙烯酸盐(methacrylate)化学物质，包括K4M、HM20、K1lM、KM23等系列产品。其特点是能在低温下保持低粘度(K4M：－35℃；HM20：－70℃；K11M、HM23：－60℃～－80℃)和具有在光照射(紫外光，波长360nm)下聚合的能力，它的光聚合作用与温度无关。; 其中K4M和K11M具有亲水性，特别适合于免疫细胞化学的应用，因为它能较好地保持组织结构和抗原性，减少背景染色。HM20和HM23具疏水性，能产生高反差图像，适用于扫描、透射电镜和暗视野观察切片的制作。所有这些种类的低温包埋剂都适用于冰冻置换技术。K4M的应用和报道较多，现介绍如下： ;包埋剂的配制： 由三个部分组成：单体(Monomer)，交联剂(Crosslinker)和引发剂(Initator)。调整单体和交联剂的比例，增加交联剂的量，组织块的硬度增加。中等硬度的组织块，其配制比例如下： K4M：单体 17.30g 交联剂 2.70g 引发剂 0.10g 可用微量注射器加针头抽取后，注入棕色的玻璃容器以避光，用玻棒轻搅3—5 min或用一小管通人液氮气泡以搅拌之。勿过分