病毒及健康病毒的纯化检测.pptxVIP

病毒及健康病毒的纯化检测第1页/共89页 病毒的纯化、检测和病毒病的诊断方法第2页/共89页 病毒的纯化Stanley 在1935年首次提纯TMV病毒纯化对病毒学发展所起的作用十分巨大.第3页/共89页 病毒的纯化前的预备工作1.繁殖病毒自然感染病毒的生物体的器官组织或细胞的量往往难以满足提纯需求,需要用人工接种寄主来大量繁殖病毒.第4页/共89页 病毒的纯化前的预备工作首先要选择最适合的寄主对植物病毒,长期以来都是接种整体植物一般说,用机械摩擦接种比昆虫媒介或嫁接等方法简便.第5页/共89页 病毒的纯化前的预备工作利用生物学方法纯化病毒采集自然感染的生物体组织器官作原材料来提纯某种病毒时,混合感染的概率很大生物学纯化:病毒在很多植物或动物细胞上产生一个个单个病毒株体第6页/共89页 病毒的纯化前的预备工作第7页/共89页 病毒纯化的基本原理病毒的释放和萃取病毒颗粒主要存在与寄主组织细胞内,因此提纯的第一步是设法破碎寄主感病的细胞第8页/共89页 病毒纯化的基本原理大多数病毒毒粒的等电点在PH4.0左右,而最稳定、溶解度最大是在PH7.0左右此时可用0.1mol/L磷酸缓冲液来处理一般破碎细胞、萃取以及以后各提纯步骤都在4℃左右进行操作。第9页/共89页 病毒萃取液的分级纯化清除较大的细胞器去除较大的细胞组分如：细胞核、线粒体、叶绿体和细胞壁等第10页/共89页 病毒萃取液的分级纯化去除寄主蛋白质1、沉淀法用各种沉淀剂来沉淀，最常用的是硫酸胺，其溶解度高，更经济。不同饱和度的硫酸胺可沉降水合化程度不同的病毒或蛋白质第11页/共89页 病毒萃取液的分级纯化 范围广泛的有机化合物的亲水性程度不同，通过与蛋白质竞争水分，使蛋白质脱水而沉淀。最常用的是乙醇和丙酮。第12页/共89页 病毒萃取液的分级纯化离心法由于大多数病毒颗粒在某种介质内的沉降速度与寄主组分有差别，使用离心法可有效地纯化病毒。第13页/共89页 病毒萃取液的分级纯化差速离心法差速离心即将低速离心所得澄清液进行超高速离心，使大部分可溶性蛋白质和小分子化合物留在上清液中，而病毒颗粒等则保留在沉降物中第14页/共89页 病毒萃取液的分级纯化密度梯度离心先在一个吊篮式离心管内由下而上铺以浓度递减的惰性致密介质，如蔗糖、甘油等第15页/共89页 病毒萃取液的分级纯化凝胶色谱法这是利用化合物分子大小和扩散速率来区分它们的方法第16页/共89页 病毒萃取液的分级纯化电泳一般较少用电泳方法制备病毒，因制备量少且繁杂。第17页/共89页 病毒的检测定性或定量的病毒检测的理论依据是病毒的理化性质，不同的方法所依据的性质不同，因此，检测结果也不一定完全相同。第18页/共89页 侵染力的测定侵染力的测定是对病毒活性的测量，也就是病毒与寄主特异反应的测定。定量测定病毒活性又称滴定。与寄主产生某种反应所用最小病毒量叫侵染单位。第19页/共89页 侵染力的测定某病毒制品的效价是指每单位体积中侵染单位的数量。动物病毒的滴定方法是计量病毒在铺满的菌落层或动物单层细胞上产生的噬斑或浊斑数。第20页/共89页 侵染力的测定一个病毒悬浮液的效价是以单位体积内的侵染单位来表示，在一定条件下即相当于毒粒数目。第21页/共89页 病毒的培养1、原代细胞猴肾细胞、兔肾细胞、人胚胎肾细胞2、二倍体细胞纤维原细胞3、连续细胞系RD、MDCK、LLC-MK2第22页/共89页 血清学方法病毒颗粒产生免疫原性的活性部分主要是外壳蛋白表面上的抗原决定簇.1、免疫沉淀法抗原和抗体在有电解质存在下可以特异地结合形成沉淀第23页/共89页 血清学方法中和试验此法常用于测知人、畜体内是否有中和抗体存在，及其该中和抗体的效价。第24页/共89页 血清学方法补体结合试验此法主要利用补体的两个特性：一是可与任何抗原—抗体复合物结合；二是免疫裂解反应必须有它的参与。第25页/共89页 血清学方法凝胶扩散法在琼脂凝胶中扩散的病毒或其抗原与其抗体相遇形成沉降带第26页/共89页 血清学方法酶联免疫吸附测定法酶标记的抗原或抗体间的特异性反应，并通过检测酶的颜色反应而定性定量检测抗原或抗体的方法。第27页/共89页 病毒核酸检测这类诊断方法针对的目标是病毒的基因组核酸第28页/共89页 病毒核酸检测杂交法关键原理是在已知病毒基因组全序列或部分序列基础上，针对某段特定序列设计一段与该序列互补的核酸序列，又称为探针。进行检测时，必须对探针进行标记。第29页/共89页 病毒核酸检测聚合酶链反应是一种对特定的DNA片段在体外进行快速扩增的方法。第30页/共89页 病毒核酸检测反转录PCR技术核心是在逆转录酶的催化作用下，将RNA病毒的基因组通过随机引物逆转录为cDNA后，再经过PCR过程将cDNA进行扩增。第31页/共89页 病毒核酸检测依赖核酸系列的