基因工程第四章目的基因的分离与修饰.pptVIP

基因工程第四章目的基因的分离与修饰;第四章 目的基因的分离与修饰;第一节 基因的基本结构特征（Character of Gene Basic Structure ）;一、原核生物基因的组成（Composition of prokaryotic Gene ）;第五页，共一百八十八页，2022年，8月28日;原核生物基因的组成 基因区：多以操纵子形式存在， ;启动区（promoter） ：DNA分子可以与RNA聚合酶特异结合的部位，转录开始的部位。 SD区：位于 AUG上游 4 ~13 个NT处的富含嘌呤的序列，为 AGGAGG。 与16S rRNA的 3’ 端(3’-UCCUCC-5’）,使AUG定位在P位。;转录终止子 (terminator) 强终止子，也称为内部终止子。 弱终止子，又称为ρ依赖终止子。 ;二、真核生物基因的组成（Composition of Eukaryotic Gene ）;真核生物基因的组成;转录启动区 单顺反子mRNA 转录终止子 ;三、其他基因组基因的组成;四、基因的排列;重复基因;加倍基因;1 目的基因 2 目的基因的制备 3 目的基因的分离;2 目的基因的制备;2.1 直接分离法-限制性内切核酸酶酶切法;对于高等真核生物而言，基因组DNA十分庞大,基因可达数万个，且基因组成结构复杂，除编码序列，还有非编码序列及调控序列，基因间还存在大量的间隔序列和重复序列， 因此，单个目的基因在整个基因组中所占的比例极其微小，除少数例外，绝大多数基因难以直接分离得到。;为了解决这个难题，一种可行的方法就是将这个基因扩增，增加成功分离目的基因的可能性。 但是由于要分离的目的基因往往是未知基因，因此无法对它进行特异性扩增， 只能对所有的基因进行扩增，也就是构建该生物材料的基因文库，然后再根据不同的方法将所需的克隆筛选出来，最后分离得到目的基因。;1）概念： 基因文库(gene library)：指某一生物类型全部基因的集合。以重组体形式出现。 基因文库由外源DNA片段、载体和宿主组成。 一个理想的基因文库应包括该生物染色体基因组全部遗传信息(即全部DNA序列)。;用途： a）分离有用的目的基因 b）保存某种生物的全部基因 ;2) 基因文库构建的基本程序： ① DNA提取及片段化，或是cDNA的合成。 ② 载体的选择及制备。 ③ DNA片段或cDNA与载体连接。 ④ 重组体转化宿主??胞。 ⑤ 转化细胞的筛选。;;基因文库技术分离目的基因----未知基因;3）基因文库的类别 基因组文库与cDNA文库 基因组文库：指将某生物的全部基因组DNA切割成一定长度的DNA片段克隆到某种载体上而形成的集合。 基因组文库分为：核基因组文库、叶绿体基因组文库及线粒体基因组文库。;;;2 目的基因的制备;2.3.1 基因组文库的概念和大小 2.3.2 λ噬菌体基因组文库的构建 2.3.3 考斯质粒基因组文库的构建 2.3.4 YAC基因组文库的构建 ;2.3.1 基因组文库(Genomic library)的概念和大小;基因组DNA文库的类型 根据所选用的载体可以分为： 质粒文库、噬菌体文库、粘粒文库、人工染色体文库（细菌人工染色体文库、酵母人工染色体文库）。;一个理想的基因组文库要有足够多的克隆子数，保证所有的基因都在克隆子群体中。 以某生物基因组约3?106kb，酶切片段平均长度15kb。;以上的例子，N值应是： ｌｎ（１－0.99） ｌｎ[ 1 -（ 15 / 3?106 ）];　基因组文库应具有的克隆子数;基因组DNA文库的质量标准;2.2.1 基因组文库的概念和大小 2.2.2 λ噬菌体基因组文库的构建 2.2.3 考斯质粒基因组文库的构建 2.2.4 YAC基因组文库的构建 ; 连接克隆载体的选择　;利用质粒载体 构建基因组文库;1）载体的特点： λ噬菌体是一种温和噬菌体，可保存在大肠杆菌中。 承载较大外源DNA，约23kb。 有多种限制酶识别位点。; ; 目的基因DNA片段化;A 机械切割法（超声波处理）： 优点：可获得较均一的随机片段， 缺点：DNA片段呈平末端，片段不能直接用于克隆，需经末端修饰，连上接头后再用限制性内切酶消化产生黏性末端。 B 限制酶消化：选用四或六核苷酸的限制性内切酶，如： （GATC） Sau3A I或Mbo I、BamH I (GGATCC)等。 优点：直接产生黏性末端， 缺点：片段的随机性较差。;基因组DNA的不完全酶切; ?载体的结构;; 重组DNA分子的包装: a. λDNA的包装物的制备: