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3-Step Platform purification, UNOsphere SUPrA CHT UNOsphere Q 4 1 2 3 1 2 3 4 5 2 4 5 0 S HPSEC Bio-Silect SEC 400-5 50mM HEPES 0.5M NaCl 2M urea, pH 7 抗体纯化平台2 第三十页，共三十五页，2022年，8月28日 * 抗体与纯化技术 第一页，共三十五页，2022年，8月28日 抗体纯化平台 实验室规模分离纯化抗体 技术 适用样品 特点 硫酸铵沉淀 血清和腹水 无需仪器操作，纯度很低，易聚集，效价受影响，得率很低 辛酸沉淀 血清和腹水 无需仪器操作，纯度较低，不易聚集，效价受影响，得率很低 DEAE 蓝胶 血清和腹水 需要仪器，纯度较高，得率较高，成本较低 Protein A/G 血清、腹水，细胞培养液 需要仪器，纯度很高，得率较高，成本较高 治疗用单克隆抗体纯化的可工业放大的实验室研发 纯度、得率要求很高，产物必须符合法规规定 Protein A UNOsphere 离子交换技术 CHT陶瓷羟基磷灰石技术 第二页，共三十五页，2022年，8月28日 抗体纯化平台1 实验室规模分离纯化抗体——辛酸沉淀 1、基本原理? ???? 在人、羊或兔血清或含有IgG的培养上清中及小鼠的腹水中加入辛酸, 可与其中大部分蛋白质形成沉淀，而对IgG的性质没有影响，因此是纯化IgG的有效途径。 沉淀后经离心即可获得IgG。辛酸沉淀法与硫酸铵沉淀法比较其主要优点为可减少聚合物的形成，但与其相同，所得的抗体纯度不够，还需用其它方法以进一步提高其纯度。 2、操作步骤? s 用烧杯加20ml 0.06 mol/L醋酸钠缓冲液（pH4.0）到10ml血液、腹水中； s 用1N HCl调节pH到4.8，后滴加辛酸同时用力搅拌，辛酸具体用量参见表1； s 在室温下继续搅拌30分； s? 5，000 ×g 室温离心30分，保留上清； s? 用1N NaOH 调节pH到5.7； s? 含有IgG的上清可以调节pH值后直接上柱精纯，或对PBS透析，然后分装、置-20℃保存。? 表1? 沉淀不同来源IgG的辛酸参考用量? IgG来源????????? 辛酸用量（每10ml血液、腹水或上清） 小?? 鼠??????????????????400μl 人??????????????????????? 700μl 羊??????????????????????? 700μl 兔??????????????????????? 750μl 注：必要时需要摸索填加量，以达到最高的纯度和得率。 第三页，共三十五页，2022年，8月28日 抗体纯化平台1 实验室规模分离纯化抗体——DEAE Affi-Gel蓝胶 Affi-Gel 蓝胶 DEAE蓝胶 CM蓝胶 配基 Cibacron Blue Cibacron Blue和DEAE Cibacron Blue和CM 动态载量 11mg/mL 0.2-1mL血清/ml 2-6mL血清/ml 建议流速 15-25cm/hr 15-25cm/hr 15-25cm/hr 应用 去除血清中的HSA 一次纯化血清或腹水中的抗体 快速去除白蛋白和血纤维蛋白溶酶原 Bio-Rad染料亲和介质（蓝胶） 交联琼脂糖 Cibacron Blue DEAE 第四页，共三十五页，2022年，8月28日 M p1 p2 p3 p4 p5 p6 S 抗体纯化平台1 实验室规模分离纯化抗体——DEAE Affi-Gel蓝胶 一步纯化兔血清抗体－DuoFlow 双功能亲和凝胶，含有DEAE和共价结合的 Cibacron blue F3GA 染料，该染料可结合白蛋白、蛋白酶和其它补体蛋白，DEAE基团可结合其余的酸性蛋白。 DEAE Affi-Gel 蓝胶特性包括: 一步纯化血清中 IgG，IgG 洗脱液中含有少量转铁蛋白 IgG 洗脱液中无蛋白水解活性 Protein A 亲和层析经济的替代品 第五页，共三十五页，2022年，8月28日 抗体纯化平台1 实验室规模分离纯化抗体——Affi-Gel, Affi-Prep Protein A纯化抗体亚型 Affi-Gel 和 Affi-Prep Protein A 层析介质，可用于获得高纯度的免疫球蛋白 (IgG) ，尤其哺乳类动物 IgG 的 Fc 段结合，功能优势包括: 高纯度的 IgG 与哺乳类动物 IgG 高亲和性 使用 MAPS II优化缓冲液，对小鼠 IgG 及其它亚类具有很高的载量 含有 Affi-Gel、Affi-Prep Protein A 介质和 MAPS II 缓冲液的凝胶 MAPS II处