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基因工程;基因工程;3 分子克隆工具酶 3.1 限制性核酸内切酶与DNA切割 概念： （restriction endonuclease）一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶(endo-deoxyribonuclease)。 生物学意义：是生物细胞内限制性修饰系统的一部分，可防止外源DNA的入侵（图）。生物在长期的演化过程中，含某种限制性核酸内切酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制性核酸内切酶的识别序列，或者通过甲基化酶把甲基转移到识别序列的碱基上，保护相应序列不被酶切割。 分布：细菌、少数霉菌和蓝藻中也有。 类型：即I、II和III型酶，各具特性(表)。分子生物学和基因工程操作中用的是II型酶。;Phage injects DNA into E. coli;; 命名：以酶的来源生物的属名和种名的第1、2个字母以及菌株（型）的代号来命名。如果从同一生物中先后提取到多种限制性核酸内切酶，则依次用罗马数字表示。例如，从 Haemophilus influenzae Rd中提取到的第三种限制性核酸内切酶被命名为Hind III。 作用机制：以环状和线形的双链DNA为底物，在合适的反应条件下，识别特定的核苷酸序列，使两条核糖核苷酸链上特定位置的磷酸二酯键断开，产生具有3’-OH基团和5’-P基团的片段(图)。 ;;黏性 (突出)末端的产生; （ii）平末端：两条链上的断裂位置处在一个对称结构的中心所形式的断裂。; II型限制性核酸内切酶的基本特性 与I及III型限制酶不同，II型酶只有一种多肽，并常以同源二聚体存在，具三个基本特性：（i）在DNA双链的特异识别序列切割DNA，产生断裂；（ii）通常2个单链断裂部位在DNA分子上不直接相对；（iii）因此，断裂形成的片段往往具有互补的单链延伸末端。 识别序列：能识别的核酸链上特殊的核苷酸序列。绝大多数的II型酶的识别序列由4～8个特定的核苷酸组成，其中以6个为多。II型酶从识别序列内切割DNA，识别序列多连续 (如GATC），少间断（如GANTC），其共同特点是，双重旋转对称的结构形式，即回文结构(图). ;; 切割位点就旋转对称轴而言位于对称的位置。产生黏性末端有两类：3’-OH; 5’-P。; DNA的识别序列数：在随机排列的DNA中，由n个核苷酸组成的内切酶识别序列出现一次的概率为4n。 有的限制酶识别序列包含在另一种限制酶识别之内(如Sau3AI ：GATC； BamHI： GGATCC) 。 识别序列的多样化：一些限制酶能识别多种核苷酸序列，如HindII。; 同裂酶：识别序列相同而来源不同的酶(isoschizomer)。; 同裂酶的用途：有些同裂酶对碱基甲基化的敏感性不同，可用来研究DNA甲基化作用。例如， HpaII和MspI的靶子是CCGG。当靶序列中有5-甲基胞嘧啶（C *C G G，*：甲基化碱基）时，HpaII不能切割，而MspI能切割。 同尾酶：来源和识别序列各不相同，但产生出相同粘性末端的酶（isocaudamer）。如BamHI、BclI、BglII、Sau3AI和XhoII，产生粘性末端GATC。 同尾酶用途：同尾酶产生的粘性末端，能够通过之间的互补作用而彼此连接。 由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点，特称之为“杂种位点”（hybrid site），一般不能再被原来的任何一种酶所识别，不过亦有例外（表）。;U：Pu，嘌呤；Y：Py，嘧啶; 影响限制性核酸内切酶活性的因子 DNA的纯度：消化速率取决于DNA的纯度。DNA制剂的污染物有蛋白、酚、氯仿、酒精、EDTA、SDS、以及盐离子等，都可能抑制制酶活。 解决途径 ①增加酶量，每微克DNA可高达10单位或以上。 ②扩大反应体积，以稀释抑制因素。 ③延长反应时间。 ④提高纯度。 ⑤加入聚阳离子亚精胺(终浓度为 1~2.5 mmol/L) 。; DNA的分子结构: 构型影响酶活，某些酶切割超螺旋的质粒或病毒DNA所需要的酶量要比消化线性DNA的高许多倍，最高可达20倍。 侧翼序列：a 大多限制酶只对两侧存在侧翼序列的