传代细胞培养实验.pptxVIP

传代细胞培养实验;为什么要学习细胞培养？;实验原理：;动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。直接从有机体获取的细胞进行的培养是原代培养，若将培养细胞洗脱后转移到另外的容器中进行在培养叫做传代培养。 目前，动物细胞培养技术已经达到一个新的阶段：从不同分化组织衍生得到的许多类型的细胞能够成功地在培养液中生长、反复传代。在维持一个独特细胞系长达数月的过程中，记录下细胞的倍增次数和生长速率是很有用的，以便在合适的时间传代以及在体外生活是中不同时间冻存细胞。;实验内容：;（3）使用超净台的方法，在每次使用前，应用紫外灯照30分钟。首先打开吹风的开关，在关掉紫外灯，打开日光灯。点燃酒精灯，开始操作。 （4）超净台表面的处理。 a. 应做到每日清洁，以使操作中溅出的培养液或其它液体及时被清除而不蓄积，达到杜绝细菌和真菌繁殖的目的。 b. 工作台中只限放置每日工作所必需的物品，其他非必须物应当除去。 c. 日常的清洁工作包括：用70%的酒精或10%的新洁而灭擦洗工作台。用固定的容器装废弃液。;;2.细胞培养所用玻璃及塑料制品的处理;3.实验者的操作技术;如果培养的细胞已经被污染，切勿直接倒掉，应高压灭菌后倒掉处理。 湿润的培养箱是常见的污染源。通常由充满液体的托盘提供培养箱合适的湿度，然而托盘本身及可导致各种细菌和真菌的污染，这种污染还可能存在与培养箱壁上和提供气体的管道上。应该定期对培养箱进行加热处理。也可以采用70%乙醇擦洗表面，并定期更换输送CO2管道，并将该管子浸泡与20%的含氯漂白剂中消毒。 为了防止交叉污染，超净台中每次应进行一种细胞系的操作。 不应用的细胞应及时丢弃处理，不应继续放置于培养箱中不予理睬。;4.细胞的处理以及维持细胞生长所需培养液的无菌处理。;培养液的pH值应为7.2至7.4。 高密度细胞使细胞培养液中葡萄糖耗竭并产生CO2和乳酸，在含酚红作为指示的培养液中，培养液将从红色变为橙色。细胞培养液长时间贮藏在4°C冰箱中，会使培养液的pH值产生变化，变碱，是培养液的颜色呈深品红紫色。应用时可用Hepes（N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸）调??。 可以向培养液中加入抗生素，比如青霉素，链霉素，庆大霉素等，抑制由于操作中的微小失误而导致的低水平的感染。但是，有时由于抗生素的加入，也会使感染不易被迅速发现。;培养液的配制：;学习传代细胞的培养技术;操作前的准备（超净台内物品摆放）;实验材料：;操作前准备（酒精灯）;试验操作步骤： ;;2.倒掉原有的细胞培养液，加入5mlPBS(-)洗涤2次。3.加入胰蛋白酶100-200μl，迅速前后旋转细胞培养瓶4-5次，以便胰蛋白酶包被所有细胞，于37°C 培养箱中孵育5分钟，消化细胞;消化细胞时的注意事项; 4.在显微镜下观察，细胞变化。待到细胞变为球形，尚未从培养瓶壁上脱落下来时，用移液管吹打，使细胞从培养瓶壁上脱落下来，加入细胞培养液2-5ml。5.如果细胞不能吹打下来，再放回培养中孵育几分钟;;6.倒入50ml离心筒中，在向细胞培养瓶中加入10ml培养液洗涤，在一并倒入离心筒中，1000-2500转离心，10分钟。;7.取出离心管，倒掉上清液，在桌面上轻敲离心筒，使沉降在离心筒底的细胞分散均匀。8.倒入5ml细胞培养液，混匀。细胞计数;细胞计数：;第27页/共35页;6.在取一细胞样品，同上在细胞板的另一小室计细胞数。 7.合计10个大方格中的细胞。算出1?10-3ml的细胞数。（每个大方格1? 10-4ml ?10个大方格?10-3ml溶剂）细胞总数乘以1000即得每毫升计数细胞悬液的细胞数。 8.计数完毕，用双蒸水清洗细胞计数板和盖玻片。用擦净纸擦干。;每毫升细胞总数 = [(A1+B1+C1+D1+E1)+(A2+B2+C2+D2+E2)] ? 103 ?2;9.取1?104个细胞放入细胞培养瓶内，加入5-8ml培养液。10.显微镜下观察。;11.将传代细胞放入培养箱中培养。12.两天后显微镜下观察细胞生长情况;活力染色：; 操作注意事项; 操作注意事项;感谢观看！