人和哺乳动物原代细胞的蛋白质抽提步骤.pdfVIP

人和哺乳动物原代细胞的蛋白质抽提步骤 一、培养的贴壁原代细胞的蛋白质抽提基本步骤 1、从贴壁细胞培养瓶中小心倾去培养液。 2、预冷的1×PBS（pH 7.4）清洗贴壁的细胞2次，小心倾去PBS。 3、蛋白质抽提试剂（1ml抽提试剂中加入5μl蛋白酶抑制剂混合液\5μlPMSF和5μ l磷酸酶混合液等等）。 4、细胞瓶中加入预冷的含抑制剂的蛋白质抽提剂（107个细胞中加入1ml抽提试剂； 5×106个细胞中加入0.5ml抽提试剂），轻轻摇动5分钟。 5、用一预冷的橡胶和塑料细胞刮将培养瓶壁上贴壁细胞刮下来，转移细胞悬浮液 到离心管中，冰浴下摇动15分钟进行裂解。 6、裂解液于预冷的离心机中14，000×g离心15分钟。弃去沉淀，上清液蛋白质抽 提物立刻转移入新的离心管中保存待用（-80oC或液氮中）。 二、培养的悬浮动物细胞的蛋白质抽提步骤 1、2500×g离心10分钟沉淀悬浮的细胞，弃去上清液 2、预冷的1×PBS（pH 7.4）悬浮沉淀细胞，2500×g离心10分钟沉淀细胞，去上清。 3、蛋白质抽提剂（1ml抽提试剂中加入5μl蛋白酶抑制剂混合液\5μlPMSF和5μl 磷酸酶混合液等等）。 4、加入预冷的含抑制剂的蛋白质抽提剂（107个细胞中加入1ml抽提试剂；5×106 个细胞中加入0.5ml抽提试剂），轻轻摇动5分钟。 5、细胞悬浮液到离心管中，冰浴下摇动15分钟进行裂解。 6、裂解液于预冷的离心机中14，000×g离心15分钟。弃去沉淀，上清液蛋白质抽 提物立刻转移入新的离心管中保存待用（-80oC或液氮中）。 三、哺乳动物组织的蛋白质抽提步骤 1、组织称重，切小块放入管中。 3、蛋白质抽提剂（1ml抽提试剂中加入5μl蛋白酶抑制剂混合液\5μlPMSF和5μl 磷酸酶混合液等等）。 3、加入预冷的含抑制剂的蛋白质抽提剂（250mg组织中加入1ml抽提试剂）。 4、用匀浆器每次30秒低速匀浆，每次匀浆间隔冰浴1分钟，至组织完全裂解。 6、裂解液于预冷的离心机中14，000×g离心15分钟。弃去沉淀，上清液蛋白质抽 提物立刻转移入新的离心管中保存待用（-80oC或液氮中）。 【注意事项】 大家在用药的时候，药物说明书里面有三种标识，一般要注意一下： 1.第一种就是禁用，就是绝对禁止使用。 2.第二种就是慎用，就是药物可以使用，但是要密切关注患者口服药以后的情况， 一旦有不良反应发生，需要马上停止使用。 3.第三种就是忌用，就是说明药物在此类人群中有明确的不良反应，应该是由医生 根据病情给出用药建议。如果一定需要这种药物，就可以联合其他的能减轻不良反 应的药物一起服用。大家以后在服用药物的时候，多留意说明书，留意注意事项， 避免不良反应的发生。 本文到此结束，谢谢大家!