生物化学核酸的物理化学性质和核酸的研究方法.pptxVIP

生物化学核酸的物理化学性质和核酸的研究方法第1页/共52页 一、核酸的水解 核酸可被水解的位点有磷酸酯键和糖苷键，其中糖苷键更易被水解。 第2页/共52页 核酸的酸水解 嘌呤碱的糖苷键比嘧啶碱的糖苷键对酸更不稳定，对酸最不稳定的是嘌呤与脱氧核糖之间的糖苷键。DNA在pH1.6于37℃对水透析可完全除去嘌呤碱；在pH2.8于100℃加热1h，也可完全除去嘌呤碱。 为了水解嘧啶糖苷键，需要较高的温度。用甲酸（98%～100%）密封加热至175℃2h，无论RNA或DNA都可以完全水解，产生嘌呤碱和嘧啶碱，缺点是尿嘧啶的回收率较低。改用三氟乙酸在155℃加热60min（对DNA）或80min（对RNA），嘧啶碱的回收率显著提高。 第3页/共52页 核酸的碱水解 RNA的磷酸酯键易被碱水解，产生核苷酸。 DNA的磷酸酯键则不易被碱水解。这是因为RNA的核糖上有2’－OH，在碱作用下形成磷酸三酯。磷酸三酯极不稳定，随即水解，产生核苷2’，3’－环磷酸酯。该环磷酸酯继续水解产生2’－核苷酸和3’－核苷酸。 DNA一般对碱稳定，若在1mol/L NaOH中加热至100℃ 4h，可以得到小分子的寡聚脱氧核苷酸。第4页/共52页 RNA的碱水解第5页/共52页 核酸的酶水解 水解核酸的酶种类很多。非特异性水解磷酸二酯键的酶为磷酸二酯酶，如蛇毒磷酸二酯酶和牛脾磷酸二酯酶。专一水解核酸的磷酸二酯酶称为核酸酶。另外还有非特异水解糖苷键的糖苷酶。 第6页/共52页 核酸酶的分类Ⅰ按底物专一性分类：作用于RNA的称为RNA酶（ribonuclease，RNase）；作用于DNA的称为DNA酶（deoxyribonuclease，DNase）。按对底物作用的方式可分为核酸内切酶（endonuclease）和核酸外切酶（exonuclease）。少数核酸酶既可内切又可外切。第7页/共52页 核酸酶的分类Ⅱ按磷酸二酯键断裂的方式可将核酸酶分为两类，一类断裂磷酸二酯键后磷酸保留在5’位，一类磷酸保留在3’位。作用于双链的为双链酶，作用于单链的为单链酶。核酸外切酶有5’→3’方向切割的，也有3’→5’方向切割的，分别称为5’→3’外切酶和3’→5’外切酶。还有对特定核苷酸序列部位进行切割的（限制性内切酶）。 第8页/共52页 二、核酸的酸碱性质碱基的解离Ⅰ胞嘧啶的解离第9页/共52页 碱基的解离Ⅱ尿嘧啶的解离胸腺嘧啶的解离第10页/共52页 碱基的解离Ⅲ腺嘌呤的解离鸟嘌呤的解离第11页/共52页 核苷的解离 核苷中由于戊糖的存在，碱基的解离常数有所下降，说明糖的存在增强了碱基上可解离基团的酸性。第12页/共52页 核苷酸的解离第13页/共52页 核酸中磷酸基的解离第14页/共52页 核苷酸的解离曲线Ⅰ第15页/共52页 核苷酸的解离曲线Ⅱ尿苷酸的碱基的碱性极弱，实际上测不出其含氮环的解离曲线，故不能形成兼性离子。第16页/共52页 小牛胸腺DNA的滴定曲线从中间往两边滴为曲线Ⅰ，非缓冲区较宽。从两边往中间滴为曲线Ⅱ，非缓冲区较窄。这种情况是DNA双链分子解链导致的第17页/共52页 三、核酸的紫外吸收 嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键，使碱基、核苷、核苷酸、核酸在240～290nm有强烈的吸收，最大吸收值在260nm附近。 紫外吸收是实验室中最常用的定量测定DNA或RNA浓度的方法。对于纯的样品，只要测出260nm的A值即可计算出浓度。通常A值为1相当于50μg/ml双链DNA，或40μg/ml单链DNA或RNA。 测定紫外吸收值还可以鉴定核酸溶液的纯度。纯DNA的A260/A280应大于1.8，纯RNA应达到2.0。若低于此值说明含有杂质。第18页/共52页 四种核苷酸的紫外吸收曲线第19页/共52页 摩尔磷吸光系数 有时核酸溶液的紫外吸收以摩尔磷的吸光度来表示。摩尔磷即相当于摩尔核苷酸。先测定核酸溶液中的磷含量及紫外吸收值，然后求出摩尔磷吸光系数。 式中A为测得的吸光度，c为磷的浓度，L为比色杯的厚度，W为每升溶液中磷的重量（克）。 第20页/共52页 DNA的增色效应和减色效应 一般天然DNA的ε(P)为～6600，RNA为7700～7800。单链核酸的ε(P)比双链核酸的大，核苷酸单体的ε(P)更大。双链DNA变性成单链后ε(P)值增大，称为增色效应；复性后ε(P)值减小，称为减色效应。这是因为双链结构使碱基对的π电子云发生重叠，减少了对紫外光的吸收。 第21页/共52页 DNA的紫外吸收光谱1.天然DNA2.变性DNA3.核苷酸总吸光度值第22页/共52页 四、核酸的变性、复性及杂交核酸的变性 核酸的变性就是双链之间的氢键断裂，成为单链。变性主要是双链DNA变成单链，也可以是单链