细胞工程动物细胞培养.pptVIP

（2）分类 一般有微载体式、中空纤维式、灌注培养式、旋转壁式等几种新型的反应器等。 第三十页，共五十四页，2022年，8月28日 分批式操作：早期采用的方式，是其它操作方式的基础。机械搅拌式生物反应器，一次性将扩大的细胞和培养液投入，在培养过程中其体积不变，不添加其它成份，待细胞增长和产物积累到适当时间，一次性对细胞，产物和培养基进行收获。 流加式操作：主流优势。机械搅拌式生物反应器，悬浮培养细胞或以微载体培养贴壁细胞，细胞初始接种的培养基体积一般为终体积的1/3－1/2，在培养过程中，根据细胞对营养物质的不断消耗和需求及时补充新的营养成份，使细胞持续生长。细胞或产物达到所需指标后终止培养，一次性回收整个反应体系，分离纯化产品。 第三十一页，共五十四页，2022年，8月28日 半连续式操作：又称为重复批式培养或换液培养，采用机械搅拌式生物反应器，悬浮培养形式。每隔一定的时间去除部分培养物，再用新的培养液补足到原有体积，使反应器内的总体积不变，并使细胞呈指数生长，可长时期进行生产，反复收获产品。 连续式操作：采用机械搅拌式生物反应器，将细胞接种到一定的培养基后，为了防止衰退期的出现，在细胞达到最大密度之前以一定速度向生物反应器连续添加新鲜培养基，同时含有细胞的培养物以相同的速度连续从反应器流出，培养体积恒定。 灌流式操作：把细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成的过程中，不断将部分条件培养基取出，同时又不断地灌注新地培养基。可采用搅拌式生物反应器悬浮培养细胞和固定床或流化床生物反应器。细胞截留系统维持较高的细胞密度；连续灌流系统使细胞处于较好的营养环境，有害代谢物浓度降低；反应速率易控制；产品在罐内停留时间短，活性好。 第三十二页，共五十四页，2022年，8月28日 第三十三页，共五十四页，2022年，8月28日 （3） 动物细胞培养的载体 实现规模化急需解决的问题 问题一 细胞贴壁生长的载体 第三十四页，共五十四页，2022年，8月28日 微载体培养技术 1967年，Van Wezel开发了微载体系统培养贴壁细胞。 微载体是直径60-250μm的微珠。多用带不同基团的葡聚糖交联成几种大分子，使其带有适当电荷或介质，以利于细胞的贴壁及生长。 第三十五页，共五十四页，2022年，8月28日 *贴壁培养的载体材料 与生物反应器系统 主要有转瓶、中空纤维、玻璃珠、微载体系统等。 后者是一重要技术，包括微载体、多空载体、微囊 第三十六页，共五十四页，2022年，8月28日 *一种微载体产品及孔状的显微结构 材料：生物相容性，机械稳定性 热稳定性 第三十七页，共五十四页，2022年，8月28日 第三十八页，共五十四页，2022年，8月28日 第一页，共五十四页，2022年，8月28日 （1）原代培养与传代培养 第二页，共五十四页，2022年，8月28日 取材 Trypsin－EDTA collagenase 取材部位是否准确 组织是否保持活性 材料处理是否恰当 第三页，共五十四页，2022年，8月28日 2 原代培养——组织块培养 组织块的培养 第四页，共五十四页，2022年，8月28日 3 传代培养——消化法 第五页，共五十四页，2022年，8月28日 一般传代培养的步骤 (1)? 吸出培养瓶内旧培养液。 (2)? 加入胰蛋白酶和EDTA混合液盖满瓶底。 (3)? 2～5分钟后检查，如有细胞间隙变大，细 胞质回缩现象，终止消化。 (4)? 吸出消化液，加入PBS液，轻轻转动以 免细胞流失，洗去残留的消化液。如果单 用胰蛋白酶，可直接加入培养液。 (5)? 用吸管轻轻吹打瓶壁，使细胞脱落制成悬 液，计数后记录其浓度。 （6）重新接种培养。 第六页，共五十四页，2022年，8月28日 （二）建立细胞系过程 第七页，共五十四页，2022年，8月28日 肿瘤细胞的体外培养与建系过程 以人上皮型食管癌109细胞系的建立为例介绍一下具体的建系过程： 第八页，共五十四页，2022年，8月28日 （1）取材 食管癌患者的手术标本 第九页，共五十四页，2022年，8月28日 （2）原代培养 1）食管肿物组织放入含青霉素和链霉素的 RPMI 1640培养液内，于4℃下静置2小 时。 2）? 然后将组织剪切成1-2mm3的小块。用含 青霉素和链霉素的RPMI 1640培养液洗 涤后，接种于预先涂有鼠尾胶原的玻璃培 养瓶中。 3）? 于37℃、CO2培养箱内培养2小时后，再 补加含20%的小牛血清的RPMI 1640培