基因工程制药二.pptxVIP

基因工程制药二第1页/共58页 2外源基因的拷贝数 外源基因是克隆到载体上的，所以载体在宿主中的拷贝数就直接与外源基因的表达相关，应将外源基因克隆到高拷贝的质粒载体上，这对于提高外源基因的总体表达水平非常有利。第2页/共58页 3外源基因的表达效率启动子的强弱核糖体接合位点的有效性SD序列和起始密码ATG的间距密码子组成第3页/共58页 4表达产物的稳定性 利用大肠杆菌的信号肽或某些真核多肽中自身的信号肽，把真核基因产物运输到胞浆周质的空隙中，而使外源蛋白不易被酶降解；组建融合基因，产生融合蛋白；采用位点特异性突变的方法，改变真核蛋白二硫键的位置，从而增加蛋白质的稳定性；选用蛋白酶缺陷型大肠杆菌为宿主细胞。 第4页/共58页 5细胞的代谢负荷 外源基因的表达产物属于异己物质，并可能对宿主细胞有毒性。调节表达物质的积累与细胞的生长和代谢之间的平衡有利于外源基因的高效表达。另外通过将细胞的生长和外源基因的表达分成两个阶段，或将宿主细胞的生长与重组质粒的复制分开两种手段也可以减轻细胞代谢的负荷。形成不溶性的包含体可以降低表达产物对宿主细胞的毒害作用。第5页/共58页 6工程菌的培养条件除宿主、载体和克隆基因三者之间的关系影响外源基因的高水平表达外，培养条件亦是非常值得研究的因素。优化培养条件使外源基因大量表达。 第6页/共58页 7真核基因在大肠杆菌中的表达形式 三种表达形式： 融合蛋白 非融合蛋白 分泌型。第7页/共58页 8融合蛋白形式表达药物基因融合蛋白的氨基端是原核序列，羧基端是真核序列，这样的蛋白质是由一条短的原核多肽和真核蛋白结合在一起的。 优点：操作简便，表达蛋白在菌体内稳定，易实现高效表达。缺点：只能作抗原用。原核多肽序列可能会影响真核蛋白的免疫原性。可再切割成两个多肽链。 第8页/共58页 9非融合蛋白形式表达药物基因非融合蛋白指在大肠杆菌中表达的蛋白质以真核蛋白的mRNA的AUG为起始，在其氨基端不含细菌多肽序列。优点：保持原有蛋白活性。缺点：易被蛋白酶破坏。第9页/共58页 10分泌型表达药物基因将外源基因接到信号肽之后，使之在胞质内有效地转录和翻译，当表达的蛋白质进入细胞外膜和细胞内膜之间的周质后时，被信号肽酶识别切割，从而释放出有生物活性的外源基因表达产物。 优点：在周质中稳定，有活性，不 含蛋氨酸残基。缺点：产量不高， 信号肽不被切割。第10页/共58页 11酵母中的基因表达载体：酵母载体是可以携带外源基因在在酵母细胞内保存和复制，并随酵母分裂传递到子代细胞的DNA 或RNA单位。从大肠杆菌中制备质粒要比从酵母中容易得多，因此酵母质粒的加工和制备大部分是通过大肠杆菌进行的，只有在最后阶段在转入酵母中。第11页/共58页 12载体的复制系列 分四类：Yep类（yeast episomal plasmid，酵母附加体质粒）YRp类（yeast replication plasmid，酵母复制型质粒）YCp类（yeast centromeric plasmid，酵母着丝粒质粒）YIp类（yeast integrative plasmid，酵母整合型质粒）第12页/共58页 13表达载体普通表达载体：只能方便地引入外源基因并进行表达，对表达产物的组成，特别是对其氮末端氨基酸是否有增减并无严格要求。精确表达载体：要求在启动子或前导肽编码序列的适当部位有内切酶位点，以利于接入外源基因，并使它在表达和加工后氮末端氨基酸序列与天然产物相同，既无多余的氨基酸，也无缺失的氨基酸。 第13页/共58页 14影响目的基因在酵母菌中表达的因素外源基因的拷贝数 外源基因的表达效率 外源蛋白的糖基化宿主菌株的影响 第14页/共58页 15外源基因的拷贝数 拷贝数要适当，高拷贝数的质粒载体可使外源基因高效表达，但会引起细胞生长量的降低，单拷贝的质粒载体对细胞的最大生长没有影响，能达到较高效的表达。第15页/共58页 16外源基因的表达效率 要使外源基因在酵母中表达必须将外源基因克隆到酵母军表达载体的启动子和终止子之间，构成表达框架。分泌信号包括信号肽部分以及前导肽部分的编码序列，它帮助后面的表达产物分泌出酵母细胞，并在适当的部位由胞内蛋白酶加工切断表达产物与前导肽之间的肽键，产生正确的表达产物。终止序列保证了转录产物在适当的部位终止和加上多聚腺苷酸尾巴，这样形成的mRNA可能比较稳定并被有效地翻译。 第16页/共58页 17外源蛋白的糖基化外源蛋白在酵母细胞中可发生N-糖苷键和O-糖苷键连接的两种不同的糖基化。外源蛋白经糖基化后可以以有效的活性型分泌到培养基中。某些蛋白质糖基化后更加稳定，便于分离精制。第17页/共58页 18宿主菌株的影响 菌体生长力强 菌体内源蛋白酶要较弱 菌体性能稳定 分泌能力强第18