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基因工程lectureDNAcloning剖析第1页/共34页 25.1 Strategy and protocols for DNA Cloning第2页/共34页 3基因克隆基因克隆又称DNA克隆，其中的一项关键技术是重组DNA技术。重组DNA是用酶学方法，将不同来源的DNA分子在体外进行特异切割、重新连接，组装成一个新的杂合DNA分子。在此基础上，这个杂合分子能够在一定的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代分子，此过程称基因克隆。 第3页/共34页 4基因克隆的技术路线①分离制备待克隆的外源DNA片段②将靶DNA片段与载体连接，组装成重组DNA分子(recombinant DNA)③重组DNA分子转入宿主细胞④筛选重组子⑤重组子的扩增和目的基因的分析第4页/共34页 55.2 目的基因的来源1. 构建genome library，从中获得特定基因2. 从mRNA构建cDNA library, 富集了所需基因3. 人工合成DNA片段4. PCR扩增特定基因片段第5页/共34页 6把DNA分子切割或连接成易于与载体连接的片段。单酶切和多酶切；完全酶切和部分酶切；DNA片段的回收。 5.3 DNA分子的片段化第6页/共34页 7Partial restriction digestionEcoR IEcoR IEcoR IEcoR IEcoR IEcoR IEcoR IComplete digestionHigh enzyme concentrationIncomplete digestionLow enzyme concentration第7页/共34页 8微型凝胶电泳DEAE纤维素膜吸附法低融点凝胶法离心柱层析凝胶DNA片段回收技术 第8页/共34页 95.4.1 外源DNA片段与载体DNA片段的三种连接方式5.4 DNA片段的体外重组第9页/共34页 105.4.2 同源粘性末端间的连接同尾酶连接时的“焊死”现象。第10页/共34页 115.4.2 同源粘性末端间的连接粘端连接需要避免的2个情况： 自身环化和两向连接。解决办法： 定向克隆和酶切分析第11页/共34页 12同一种内切酶生产的粘性末端的连接第12页/共34页 13第13页/共34页 14第14页/共34页 155.4.3 平端连接平头末段连接的特点平头末端连接的问题第15页/共34页 165.4.4定向克隆的技术路线 质粒载体用BamH I和Hind III消化-〉产生BamH I和HindⅢ的粘性末端-〉与BamH I和Hind III所切出末端相匹配的外源DNA片段相连接外源基因只能以一个方向连接于载体中：外源DNA片段的两端位点不同，线性DNA(载体或外源DNA片段)的两个非互补粘端自身环化的几率显然会大大降低。第16页/共34页 175.4.5 DNA末端的修饰改造1.粘性末端修饰成平头末端后连接第17页/共34页 185.4.5 DNA末端的修饰改造2. 同聚物加尾连接在末端转移酶(terminal transferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。第18页/共34页 19第19页/共34页 203. 人工接头(linker)连接由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。人工合成的、含有限制性内切酶识别序列的、短的双链DNA片段。4. DNA插口技术(adaptor)：人工合成的、具有粘性末端寡聚核苷酸。5.4.5 DNA末端的修饰改造第20页/共34页 21人工接头及其应用CCGAATTCG GGCTTAAGC5′-3′-Eco RⅠEco RⅠEco RⅠEco RⅠ第21页/共34页 22● 受体细胞(receptor cell) 又称为宿主细胞或寄主细胞(host cell)等，从实验技术上讲是能摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞;从实验目的上讲是有应用价值和理论研究价值的细胞。 ● 感受态(competence) 细胞处于能够吸收DNA的状态，称为感受态。● 感受态细胞(competence cell) 处于能够吸收DNA状态的细胞。5.5 重组DNA分子转入受体细胞第22页/共34页 23选择受体细胞的基本原则①便于重组DNA分子的导入。②便于重组体的筛选。根据所用的表达载体所含的选择性标记与受体细胞基因是否相匹配，从而易于对重组体进行筛选。③遗传稳定性高，易于进行扩大培养或易于进行高密度发酵而不影响外源基因的表达效率。对动物细胞而言，所选用的受体细胞具有对培养的适应性强，可以进行贴壁或悬浮培养，可以在无血清培养基中进行培养。 第23页/共34页 24④受体细胞内内源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低，利于外源蛋白表达产物在细胞内积累，可促进外源基因高效分泌表