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实验三基因的PCR扩增技术第1页/共16页第2页/共16页实验三基因的PCR扩增技术第3页/共16页一、实验目的学习PCR反应的基本原理与实验技术从BCG基因组DNA中PCR扩增Rv1791（PE19）基因第4页/共16页二、基本原理PCR类似于DNA的天然复制过程。将待扩增的DNA片段与其两侧互补的两段寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增倍数可达2n倍。第5页/共16页5’ 3’解旋酶类DNA聚合酶 dNTP引物 体内DNA的复制第6页/共16页变 性加热复温复性加热或强酸、碱性作用可以使 DNA双螺旋的氢键断裂,双链解离,形成单链DNA,这称为 DNA的变性。解除变性的条件后, 变性的单链可以重新结合起来,形成双链,其原有的特性和活性可以恢复,这称DNA复性, 也叫退火。 DNA的变性和复性第7页/共16页引物5’3’3’5’变性、退火延伸变性、退火延伸PCR扩增原理第8页/共16页1 反应体系 总体积25-100 ?l Buffer 缓冲液 dNTP 原料 Primer引物 DNA分子模板 Taq酶DNA聚合酶 第9页/共16页三、实验材料BCG基因组DNA10?PCR反应缓冲液、4?dNTPs、Taq DNA聚合酶、模板DNA、引物 （P1、P2）、超纯水SWPCR反应管、移液器、 PCR仪、离心机第10页/共16页四、实验步骤引物设计准备PCR反应溶液PCR扩增反应结果检测第11页/共16页Rv1791-F： ATGAATTCAGGAAGACAGCATGTCGTTC（EcoR I）Rv1791-R：ATCTCGAGTGTTCCCCCTCTCCTTCAG（XhoI）第12页/共16页（二）准备PCR反应溶液 10×PCR反应缓冲液2.5μl 4×dNTPs 2.0μl 引物P1 1μl（10nM） 引物P2 1μl 模板DNA 2μl Taq DNA聚合酶0.2μl 用无菌去离子水至25μl ↓ 用手指轻弹PCR反应管管底部，使溶液混匀 ↓ 在台式离心机中离心2秒以集中溶液于管底第13页/共16页（三）PCR扩增反应在PCR仪中设计如下反应程序：94?C、5min；94?C、30sec，61?C、40sec，72?C、30sec，30个循环；72?C、5min将已混匀的PCR反应管置于PCR仪的反应孔中，盖好盖子进行反应。反应完毕，将样品取出置于冰浴中待用第14页/共16页（四）结果检测 本PCR扩增的产物DNA片段长度为300bp，适合于在1.5%琼脂糖凝胶中进行电泳检测。从每个反应管中取5ul PCR产物进行电泳检测。 第15页/共16页12345循环94℃ 30s56.5℃ 40s72℃ 60s94℃ 30s57.7℃ 40s72℃ 6094℃ 30s58.6℃ 40s72℃ 60s94℃ 30s59.9℃ 40s72℃ 60s94℃ 30s61.1℃ 40s72℃ 60s第16页/共16页感谢您的欣赏
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