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生物显微技术染色和组织化学第1页/共31页第2页/共31页媒染剂：组织—媒染剂---染料 复合体。增强剂：加强染色的选择强度。加速剂：加强染料的渗透作用。第3页/共31页苏木精(hematoxylin)、伊红（eosin）染色法（ＨＥ染色） 苏木精将细胞核染成紫蓝色，伊红将细胞质（浆）染成红色。苏木精是具有阳离子的碱性染料，可以与具有阴离子基因的组织成分耦合成盐，凡组织结构对苏木精起紫蓝色反应的称为嗜碱性（basophil）。伊红是具有阴离子的酸性染料，可以与具有阳离子基因的组织伊红起红色分耦合成盐，凡组织结构对伊红起红色反应的称为嗜酸性（acidophil）。对碱性或酸性染料亲和力均不强者，则称为中性。 第4页/共31页Delafield 苏木精液苏木精4g无水乙醇25ml（溶解）10%铵矾水400ml，甘油100ml，甲醇或95%乙醇100ml。阳光空气中放3-4个月第5页/共31页石蜡切片苏木精染色步骤切片脱蜡：二甲苯两次，每次10-20分钟。梯度酒精下行入水：100%--90%--80%--70%--60%--50%--水苏木精染色10分钟左右，水洗。分色：1%盐酸的70%乙醇中。使核着色，核以外的成分无色。水洗。1%伊红的70%酒精复染1分钟95%乙醇分色第6页/共31页95%乙醇漂洗，无水乙醇脱水。无水乙醇：二甲苯=1：1 一次二甲苯两次加胶封片第7页/共31页ＨＥ染色结果细胞核蓝紫色，细胞质、胶原纤维、肌纤维呈不同色调的粉红色。 第8页/共31页进行性染色：退行型染色：分色第9页/共31页 组织化学第10页/共31页定义组织化学也称细胞化学，是在组织的原位上显示并研究其化学性质和功能关系的一门科学技术。组织化学是细胞形态学与化学、生物化学之间的边缘科学。根据已知的化学反应，在细胞原位上以化学反应显示出该细胞中的化学成分、性质、及其变化，从而将结构和机能更紧密的联系在一起。第11页/共31页借助这一技术可以：直接观察到细胞的形态特征；可以观察到该细胞的化学成分、化学性质；在不同生理状态下，组织形态、化学性质的变化研究可以阐明细胞的功能。第12页/共31页组织化学的技术要求保存细胞的生前结构。保存细胞生前的化学成分和酶活性。所用的化学方法是已知的化学反应，具有高度的特异性。反应产物应是一种能形成稳定沉淀的有色物质，供光镜观察；或电子密度高的物质供电镜观察。第13页/共31页组织化学的特点定性定位相对定量研究细胞或组织中的化学物质。第14页/共31页研究内容蛋白质：酶类、抗原等具有某种特异功能的蛋白。核酸：DNA和RNA糖类脂类无机盐和微量元素第15页/共31页糖类显示最常用于显示细胞、组织内的多糖和蛋白多糖的方法是过碘酸-雪夫反应（periodic acid Schiff，PAS反应)。基本原理是：糖被强氧化剂过碘酸（HIO4)氧化后，形成2-醛基；后者与Schiff试剂中的无色品红亚硫酸复合物结合，形成紫红色反应产物,PAS反应阳性部位即表示多糖的存在。 第16页/共31页 脂类显示 脂类物质包括脂肪与类脂。标本可用甲醛固定、冷冻切片、用油红、苏丹Ⅲ、苏内Ⅵ、苏丹黑B、尼罗蓝等脂溶性染料染色；亦可用饿酸固定兼染色，脂类呈黑色。 第17页/共31页核酸显示显示DNA的传统方法为Feulgen反应。切片先经稀盐酸处理后， 使细胞内DNA水解，打开DNA分子中胶氧核糖核酸和嘌呤碱之间的连接按键，使其释放出醛基，再用Schiff试剂处理，形成紫红色反应产物。　如用甲基绿-派若宁反应，可同时显示细胞内的DNA和RNA甲基绿与细胞核中的DNA结合呈蓝绿色，派若宁与核仁及胞质内的RNA结合呈红色。 第18页/共31页分类一般组织化学 它的基本原理是在组织切片上滴加一定试剂，使它与组织细胞内某种化学物质起反应，并在原位形成有色沉淀产物，通过观察该产物，可对某种化学物质进行定位、定性及定量的研究。 荧光组织化学 它的基本原理是用荧光显微镜以短光波紫外线作光源，紫外线可激发标本内的荧光物质，使其呈现荧光图象，借以了解细胞组织中的不同化学成分的分布。 免疫组织化学 是近年来发展起来的新技术。它的基本原理是利用抗原与抗体特异性结合的特点，检测细胞中某种肽类及蛋白质等大分子物质的分布第19页/共31页第20页/共31页酶类的显色方法酶的分类水解酶氧化还原酶转化酶连接酶裂解酶异构酶第21页/共31页酶的组织化学反应偶氮染料法吲哚酚法金属盐法氧化-还原反应第22页/共31页第23页/共31页碱性磷酸酶钙-钴显示法原理：RPO3-------ROH+H3PO42H3PO4 +3Ca(NO3)2----Ca3(PO4)2 +6HNO3Ca3(PO4)2 + 3Co(NO3)2 ---- Co(PO4)2 + 3Ca(NO3)2Co(PO4)2 +3