基因工程的酶学基础1.pptxVIP

基因工程的酶学基础1; 用于核酸操作的工具酶;一、限制性核酸内切酶;2. 性质;;细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。; DNA甲基化是表观遗传学(Epigenetics)的重要组成部分，在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要作用，是目前新的研究热点之一。 甲基化检测方法分为三类： 基因组整体水平的甲基化检测 基因特异位点甲基化的检测 新甲基化位点的寻找。 ; 在人类基因组中,DNA甲基化是一种表观遗传修饰,它与肿瘤的发生关系密切。 抑癌基因和DNA修复基因的高甲基化、重复序列DNA的低甲基化、某些基因的印记丢失与多种肿瘤的发生有关。 ;MeDIP Sequencing（Methylated DNA Immunoprecipitation Sequencing ）采用甲基化DNA免疫共沉淀技术，通过5‘-甲基胞嘧啶抗体特异性富集基因组上发生甲基化的DNA片段，然后进行高通量测序。 研究人员可以利用MeDIP Sequencing快速有效地寻找基因组上的甲基化区域，从而比较不同细胞、组织、甚至疾病样本间的DNA甲基化修饰模式的差异。;;DpnI;目前鉴定出三种不同类型的限制性内切酶。;首先由M. Meselson和R. Yuan在1968年从大肠杆菌 B株和 K株分离的。如 EcoB和 EcoK。 是大型的多亚基蛋白复合物，由三种不同的亚基组成。既具有内切酶的活性，又具有甲基化酶的活性。;需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。;首先由H.O. Smith和K.W. Wilcox在1970年从流感嗜血菌中分离出来。;EcoR I 5’-G?AATTC-3’ 3’-CTTAA?G-5’ Pst I 5’-CTGCA?G-3’ 3’-G?ACGTC-5’ 产生粘性末端;（3）粘性末端（sticky ends，cohensive ends）;; ①连接便利;;③ 补平成平齐末端;识别位点的序列相同的限制性内切酶。;Xma I 5’-C?CCGGG -3’ 3’-GGGCC?C-5’ Sma I 5’-CCC?GGG-3’ 3’-GGG?CCC-5’;识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamH I、Bgl Ⅱ、Bcl I、Xho Ⅱ等;5’-?GATC----3’ 3’----CTAG?-5’ ;在离它的不对称识别位点一侧的特定距离处切割DNA双链。;3. III型限制性内切酶 ;核酸限制性内切酶的类型及主要特性;;获得序列未完全清楚的核酸的一种引??设计方案，特点是所设计的引物序列某位置的核苷酸可以分别是两个或两个以上不同的碱基，结果所合成的引物是该位置上不同序列的混合物。 ;1973年H.O Smith和D. Nathans提议的命名系统，命名原则如下：;;DNA中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都会影响酶的活性。;大肠杆菌一般有两种甲基化酶修饰质粒：;不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是37 oC，少数要求40-65 oC。;是影响限制酶活性的重要因素。;高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的Star activity现象。; II 型核酸内切酶的多酶联合酶切：;对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法：; 部分酶切应采取的措施： ;物理作图: 限制性作图法（ restriction mapping ）:是通过比较不同限制性酶产生的DNA片段的大小，将限制性酶切位点标定在DNA分子的相对位置上，构建物理图谱的方法。 ; 现要将一个目的基因克隆到表达载体上, 目的基因通过设计基因特异的引物PCR扩增得到, 如何设计酶切位点?(载体的多克隆位点有BamHI, HindIII) 2.一长为4.2kb的DNA片段，分别用EcoRI、PstI及EcoRI+PstI消化，电泳结果如下图所示，请根据结果绘出该片段限制性图谱。;第二节 DNA 连接酶;（1）大肠杆菌连接酶;（1）必须是两条双链DNA。;连接酶反应的最佳温度是37?C。;增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。;从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢得多。;加大连接酶用量（10倍大于粘性末端的连接） ;第三节 DNA聚合酶;1. 共同特