目的基因克隆基因工程原理与技术刘志国.pptxVIP

目的基因克隆基因工程原理与技术刘志国;本节要点 ;一、RT-PCR法;常用RNA模板;采用亲和层析法;基因特异引物（gene specific primer，GSP） 多聚寡核苷酸引物（oligo (dT) primer） 随机六核苷酸引物（random hexamer primer）;以合成的cDNA单链为模板，采用基因特异引物进行常规PCR扩增 过程：;2. 三种不同引物引导的RT-PCR;第一节 PCR扩增法获得目的基因 ;3. 已知基因N端部分序列RT-PCR;第一节 PCR扩增法获得目的基因 ; 获得的目的基因的DNA片段不完整，仅知道基因上一小段序列信息时;用于扩增已知目的基因序列侧翼的DNA片段 ;第一节 PCR扩增法获得目的基因 ;1. 锚定PCR;第一节 PCR扩增法获得目的基因 ;第一节 PCR扩增法获得目的基因 ;第一节 PCR扩增法获得目的基因 ;在普通PCR过程中增加了连接的步骤，即通过连接反应加上去一个公共接头;引物;第一节 PCR扩增法获得目的基因 ;4. 盒式PCR;Cassette在设计时其5′末端没有磷酸基团 目的DNA片段的3′末端和Cassette的5′末端的连接部位形成缺口 在第一次PCR的第一个循环，从Cassette引物 CP1开始的延伸反应在连接部位终止，限制了引物 CP1和引物 CP1同一引物之间的扩增，减少了非特异性PCR扩增;第一节 PCR扩增法获得目的基因 ;5’端之间的未知序列 5’RACE ;锚定PCR被用于RACE技术，根据锚定序列引入方式的不同，RACE分为经典RACE和新RACE ;经典3’RACE操作步骤;第一节 PCR扩增法获得目的基因 ;经典5’RACE操作步骤;第一节 PCR扩增法获得目的基因 ;新型5’RACE操作步骤;第一节 PCR扩增法获得目的基因 ;第二节 基因的合成 ;一、DNA人工合成的原理 ;第35页/共123页;二、人工合成基因 ;1、退火-连接法 ;2、多步退火-延伸-连接法;3、由内向外多步退火-延伸合成法;第三节 基因组DNA的克隆;基因组文库构建;● 一般流程;● 一般流程;●高分子量环境样品DNA的准备;PFGE分离大片断DNA分子;●载体的选择和制备;BAC （Bacteial artificial chromosome）vector 细菌人工染色体载体结构; BAC 载体特点;●连接; 大片段DNA 是否能有效连接在载体上主要取决于插入 DNA 片段与载体的比例, 对于不同生物采用的比例不同, 大多数BAC 文库采用1∶5 - 15 (摩尔比) ;● 转化;● 阳性克隆的挑选;●BAC 文库的鉴??;　BAC 文库的鉴定; 以Southern 杂交来检验BAC 克隆插入片段是否 来源于原材料。检验假阳性克隆, 保证库的质量; BAC 文库的快速筛选;第57页/共123页;基因组文库在环境微生物分子生态中的应用与意义;海洋环境BAC文库发现了海洋变形细菌视紫红质的结构模型;第四节 cDNA文库构建及筛选 ;什么叫做cDNA文库？;构建cDNA文库的基本步骤：;内 容 提 要;一、RNA提取与质量鉴定;1. 细胞总RNA的提取;实验室常用：异硫氰酸胍法（ Trizol ）;2. mRNA的分离纯化;磁珠吸附洗脱法分离mRNA;3. RNA的质量鉴定 ;1. cDNA第一链的合成;1. cDNA第一链的合成;cDNA第一链合成;2. 第二链cDNA的合成;Poly（T）引物;置换合成法 合成cDNA的第一链形成mRNA:cDNA杂交链； RNAaseH酶降解mRNA； mRNA链上出现切口，产生一系列mRNA引物； 大肠杆菌DNA聚合酶合成cDNA的第二链。;（1）修饰cDNA两端 接头：人工合成的双链寡核苷酸，含酶切位点。 末端转移酶：形成oligo （dG ）、 oligo （dC）或oligo（ dT）、 oligo （dA） ;（2）双链cDNA的克隆 cDNA文库的载体主要有三种： 质粒：仅在构建较高丰度cDNA文库和次级cDNA文库时使用 （优、缺点） 噬菌体：应用最为广泛 （优、缺点） 噬菌粒：兼具前两代的优点 ;cDNA文库构建过程示意图 ;三、cDNA文库的质量评价;差异克隆技术;基因表达的变化是调控细胞生命活动过程的核心机制，高等生物含有数万个不同的基因，但在生物体发育的某一阶段只有约10-15%的基因按时空顺序有序地进行表达，这种表达方式即为基因的差别表达（differential expression）。 ;研究同一类细胞在不同生理状态下或在不同生长发育阶段基因表达的差异的方法很多，有代表性的技术主要有mRNA差异显