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CRISPR基因编辑技术演示文稿 目前一页\总数三十二页\编于十一点 CRISPR基因编辑技术 目前二页\总数三十二页\编于十一点 自从证明DNA是遗传物质以后，人类就开始了通过改变DNA来改造生物体生理机理和功能的尝试。 1973年，斯坦利·N·科恩(Stanley N. Cohen)和赫伯特·W·博耶(Herbert W. Boyer) 成功将蛙的DNA插入到细菌中。 20世纪70年代，基因泰克(Genetech)公司对大肠杆菌进行基因改造，使其带有一个人源基因(这个基因是人工合成的)，最后生产出治疗糖尿病的胰岛素。 1974年，，加利福尼亚州索克生物研究所(Salk Institute for Biological Studies)的Rudolf Jaenisch通过将SV40 病毒的DNA注射到小鼠的囊胚中,培育出了第一只转基因小鼠。 目前三页\总数三十二页\编于十一点 基因突变技术：物理诱变、化学诱变… 转基因技术：T-DNA插入 RNA干扰技术：dsRNA、Artificial miRNA 核外遗传技术：质粒、人工染色体 同源重组技术：e.g. 传统的基因敲除小鼠 无法控制突变位点 不能精确控制外源基因插入位点 对靶基因抑制不彻底、不特异 难以稳定的遗传 费时费力费钱，难以大量应用 并引起一系列生物伦理的问题… 现 状 目前四页\总数三十二页\编于十一点 目前五页\总数三十二页\编于十一点 基因组编辑技术 基因组编辑技术（genome editing）是一种可以在基因组水平上对DNA序列进行改造的遗传操作技术。也称为基因打靶（Gene targeting）。 技术的原理是构建一个人工内切酶，在预定的基因组位置切断DNA，切断的DNA在被细胞内的DNA修复系统修复过程中会产生突变，从而达到定点改造基因组的目的。 目前六页\总数三十二页\编于十一点 历史 1993年前ZFN就已开始出现，迄今已发展了20多年才有今天的成就； 2009年底出现的TALEN似乎一夜之间呈现出取代ZFN的架势； 2012年底CRISPR/Cas已显现出取代TALEN的巨大潜力，在2013年成为现实。 荣誉 2011年：ZFN， TALEN和Meganuclease—2011年度方法（Nature Methods） 2012年：TALEN — 2012年十大突破（Science） 2013年：CRISPR/Cas被认为是诺贝尔奖级别的成果，华人科学家张峰已因此获得生物医学大奖。 基因组编辑技术 应用 基因组巡航导弹，分子剪刀，DNA外科医生 定点突变，定点修饰（包括得到转基因），转录调控 基因治疗（如遗传病） 目前七页\总数三十二页\编于十一点 基因编辑的三大利器 ZFN (Zinc-finger nucleases, ZFN) TALEN（transcription activator-like effector nucleases) CRISPR/Cas (clustered regulatory interspaced short palindromic repeat /Cas-based RNA-guided DNA endonucleases） 特异性 DNA识别域 非特异性 核酸内切酶 + 目前八页\总数三十二页\编于十一点 * ZFN原理 ZFN=蛋白的DNA识别域+核酸内切酶 DNA识别域： 由一系列 Cys2-His2锌指蛋白（zinc-fingers）串联组成（一般3~4个），每个锌指蛋白识别并结合一个特异的三联体碱基。 目前九页\总数三十二页\编于十一点 * 核酸内切酶： 非特异性核酸内切酶FokI，形成二聚体时切割双链DNA 两条ZFN之间具有被称为“间隔区”的spacer结构，该结构的长度以5～6bp为宜，7bp也能正常工作，合理的“间隔区”设计才能保证ZFN二聚体拥有最佳的工作空间。 目前十页\总数三十二页\编于十一点 ZFN技术的缺陷 DNA识别域虽然具有较强的特异性识别能力，但是其识别的序列长度比较有限。 因为ZFN剪切的过程不完全依赖同源二聚体的形成，所以一旦形成异源二聚体，就很可能造成脱靶效应； 如果出现脱靶，可能导致DNA的错配和序列改变，产生较强的细胞毒性。当这些不良影响积累过多，超过细胞修复机制承受的范围时，便会引起细胞的凋亡。 另一方面，该手段在细胞内部操作的精确程度不足，则可能会引起相关基因突变，引发癌症等。 ZFN 作为基因治疗的手段之一，如果在生物体内使用，可能会引发免疫反应。而现有的研究手段尚不能预测引入的ZNF蛋白是否会引起免疫系统的进攻。 到目前为止，ZFN技术只能用于体外操作（in vitro），在对人体提取的细胞进行处理之后，再导入回