农业农村部公告第323号-1-2020CN.docx

ICS 65.020.01 B 04 中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准 农业农村部公告第323号— 1—2020 转基因植物及其产品成分检测 番木瓜内标准基因定性PCR 方法 Detection of genetically modified plants and derived products— Target-taxon-specific qualitative PCR method for Papaya 2020-08-04发布 2020-11-01实施 中华人民共和国农业农村部发布 I 农业农村部公告第323号—1—2020 前 言 本标准按照 GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由中华人民共和国农业农村部提出。 本标准由全国农业转基因生物安全管理标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：农业农村部科技发展中心、华南农业大学、中国热带农业科学院。 本标准主要起草人：姜大刚、李夏莹、潘志文、王颢潜、高洁儿、陈伟庭、姚涓、周峰、王声斌、李美英、肖 苏生。 1 农业农村部公告第323号— 1-2020 转基因植物及其产品成分检测 番木瓜内标准基因定性 PCR 方法 1 范围 本标准规定了番木瓜内标准基因Papain、Chymopapain 的定性 PCR 检测方法。 本标准适用于转基因植物及其制品中番木瓜成分的定性PCR 检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 农业部1485号公告—4—2010 转基因植物及其产品成分检测 DNA 提取和纯化 农业部2031号公告— 19—2013 转基因植物及其产品成分检测 抽 样 NY/T 672 转基因植物及其产品检测 通用要求 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 Papain 基因 Papain gene 编码番木瓜蛋白酶的基因，Genbank 登录号为M15203, 在番木瓜基因组中为2个拷贝。 3.2 Chymopapain 基因 Chymopapain gene 编码番木瓜凝乳蛋白酶的基因，Genbank 登录号为AY803756, 在番木瓜基因组中为1个拷贝。 4 原理 根据 Papain、Chymopapain 基因序列设计特异性引物及探针，对试样进行 PCR 扩增。依据是否扩 增获得预期的DNA 片段或典型扩增曲线，判断样品中是否含有番木瓜成分。 5 试剂和材料 除非另有说明，仅使用分析纯试剂和重蒸馏水。 5.1 琼脂糖 5.2 10g/L 溴化乙锭(EB) 溶液：称取1.0g 溴化乙锭，溶解于100mL 水中，避光保存。 警告——溴化乙锭有致癌作用，配制和使用时应戴一次性手套操作并妥善处理废弃物。 注：根据需要可选择其他效果相当的核酸染料代替溴化乙锭作为核酸电泳的染色剂。 5.3 10 mol/L氢氧化钠(NaOH) 溶液：在160 mL 水中加入80.0 g 氢氧化钠，溶解后，冷却至室温，再加 水定容至200 mL。 5.4 500 mmol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na?) 溶液(pH 8.0):称取18.6 g 乙二胺四乙酸二钠，加入 70mL 水中，缓慢滴加氢氧化钠溶液(见5.3)直至EDTA-Na? 完全溶解，用氢氧化钠溶液(见5.3)调 pH 至8.0,加水定容至100 mL。 在103.4 kPa(121℃) 条件下灭菌20 min。 5.5 1mol/L 三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCI) 溶 液(pH8.0): 称取121. 1g 三羟甲基氨基甲烷溶解于 800mL 水中，用盐酸调pH 至8.0,加水定容至1000 mL。 在103.4 kPa(121℃) 条件下灭菌20 min。 5.6 TE 缓冲液(pH8.0): 分别量取10mL 三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液(见5.5)和2mL 乙二胺四乙酸 2 农业农村部公告第323号— 1—2020 二钠溶液(见5.4),加水定容至1000 mL。 在103.4 kPa(121℃)条件下灭菌20 min。 5.7 50×TAE 缓冲液：称取242.2 g 三羟甲基氨基甲烷(Tris),先用500 mL 水加热搅拌溶解后，加入 100mL 乙二胺四乙酸二钠溶液(见5.4),用冰乙酸调pH 至8.0,然后加水定容至1000 mL。 使用时用水 稀释成1×TAE。 5.8 加样缓冲液：称取250.0mg 溴酚蓝，加入10mL 水，在室