NY_T 3641-2020CN 欧洲甜樱桃品种鉴定 SSR分子标记法.docx

ICS 65.020.01 B 05 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 NY/T 3641—2020 欧洲甜樱桃品种鉴定 SSR 分子标记法 Identification of sweet cherry varieties using SSR marker method 2020-07-27 发布 2020-11-01 实施 中华人民共和国农业农村部发布 I NY/T 3641—2020 目 次 前言 Ⅱ 1 范围 1 2 规范性引用文件 1 3 术语和定义 1 4 仪器设备及试剂 1 5 溶液配制 1 6 引物相关信息及使用 1 7 参照品种及使用 1 8 操作程序 1 9 数据记录与统计 3 10 判定方法 3 附录A(规范性附录)仪器设备及试剂 4 附录B(规范性附录)溶液配制 6 附录C(规范性附录)核心引物名单及序列 8 附录 D(资料性附录)核心引物相关信息 9 Ⅱ NY/T 3641—2020 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由农业农村部种业管理司提出。 本标准由全国植物新品种测试标准化技术委员会(SAC/TC 277)归口。 本标准起草单位：中国农业科学院郑州果树研究所。 本标准主要起草人：李明、刘聪利、齐希梁、李玉红、宋露露。 1 NY/T 3641—2020 甜樱桃品种鉴定 SSR 分子标记法 1 范围 本标准规定了利用简单重复序列(Simplc sequencc repeat,SSR)标记的遗传多态性进行欧洲甜樱桃 (Prunus avium L.)品种鉴定的操作程序、数据记录与统计、判定规则。 本标准适用于欧洲甜樱桃品种的 SSR 指纹数据采集及品种鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改版)适用于本文件。 NY/T 2594 植物品种鉴定 DNA 分子标记法 总则 NY/T 3056 植物品种特异性、 一致性和稳定性测试指南 樱桃 3 术语和定义 NY/T 2594界定的以及下列术语和定义适用于本文件。 3.1 核心引物 core primer 品种分子鉴定优先选用的一套引物，具有多态性高、重复性好等综合特性，可用于品种 DNA 指纹数 据采集和品种鉴定。 3.2 参照品种 reference variety 对应于特定位点不同等位变异的一组品种，用于辅助确定待测样品在某个位点上等位变异扩增片段 的大小，校正仪器设备的系统误差。 4 仪器设备及试剂 见附录 A。 5 溶液配制 见附录 B。 6 引物相关信息及使用 核心引物名单及序列见附录 C,核心引物相关信息见附录 D。 7 参照品种及使用 参见附录 D。 8 操作程序 8.1 样品制备 每个品种检测3个单株，进行混样分析。当一致性结果较差时，进行单独取样分析。 8.2 DNA 提取与检测 采用CTAB 法。选取欧洲甜樱桃幼嫩叶片或芽(0.2g 左右)在液氮中研磨至粉末，迅速将粉末移入 2 NY/T 3641—2020 2.0mL 离心管；每管加入700μL65℃ 预热的2% CTAB 缓冲液，轻摇混匀；65℃水浴30 min, 期间多次 颠倒混匀以确保充分裂解。于4℃ 12000g 离心10 min;取上清液，每管加入等体积的氯仿-异戊醇(24: 1)混合液，充分混匀后，12000 g 离心10 min;取上清液到新的2 mL 离心管中，再加入1mL-20℃ 预冷 的异丙醇，颠倒混匀沉淀 DNA, 并于-20℃条件下放置30 min 以上，于4℃ 12000g 离心15 min,弃上清 液；用75%乙醇浸泡清洗沉淀2次，风干，将沉淀物溶解于200 μL 灭菌超纯水中，使用核酸蛋白浓度测定 仪进行浓度测定， -20℃保存备用。 注：以上为推荐的一种 DNA 提取方法。所获 DNA 质量能够符合 PCR 扩增需要的DNA 提取方法都适用于本标准。 8.3 PCR 扩增 8.3.1 引物选择 选择附录C 中17对引物进行检测。 8.3.2 反应体系 10μL 反应体系： DNA1μL(30ng/μL)、10×PCR 反应缓冲液(含Mg2+)1μL、dNTP 0.8μL(2.5 mmol/L)、 正反向引物各0.4 μL (10 μmol/L),Taq 酶0 . 2 μL (5U/μL), 灭菌超纯水6.2μL, 在 PCR 扩 增仪上