生物技术概论-基因工程.pptVIP

提高载体和外源DNA连接效率的方法： 1、提高外源DNA片段与载体的分子比：5 : 1 - 10 : 1； 2、载体DNA分子在连接前先除去5’-P。 第九十五页，共一百三十八页。 B 重组DNA分子的转化和扩增（转与增） 转化细胞的扩增 转化的原理与技术 影响转化效率的因素 第九十六页，共一百三十八页。 Ca2+诱导转化法 重组DNA分子导入原核细胞 原生质体转化法 ?噬菌体DNA的转染 电穿孔转化法 三亲本杂交转化法 第九十七页，共一百三十八页。 用限制性内切酶切割基因组DNA，得到很多与基因大小相当的DNA片断，把这些片段混合物随机插入载体，转化大肠杆菌，做成基因组文库，再通过核酸分子杂交，选择出含目的基因的DNA片断。仅适用于原核基因的分离。 1、直接从染色体DNA中分离 第六十三页，共一百三十八页。 2、化学合成法 化学合成法的前提条件是已知目的基因的DNA序列，有三种战略： 小片段粘接法 补钉延长法 大片段酶促法 第六十四页，共一百三十八页。 小片段粘接法： 混合退火 根据目的基因序列，分别合成12-15 bp的单链DNA小片段 T4-DNA ligase连接 克隆入合适的载体 第六十五页，共一百三十八页。 补钉延长法： 混合退火 根据目的基因序列，分别合成12-15 bp的单链DNA小片段以及20-30 bp长的单链DNA中片段 T4-DNA ligase连接 克隆入合适的载体 Klenow酶聚合 第六十六页，共一百三十八页。 大片段酶促法： 混合退火 根据目的基因序列，分别合成40-50 bp的单链DNA片段 T4-DNA ligase连接 克隆入合适的载体 Klenow酶聚合 第六十七页，共一百三十八页。 采用一定方法钓取特定基因的mRNA，再通过逆转录酶催化合成cDNA，除去RNA链后，再用DNA聚合酶I（或Klenow）合成其互补DNA链，从而得到双链DNA。这一方法可得到可表达的完整基因。 3、从mRNA合成cDNA 第六十八页，共一百三十八页。 双链平头cDNA使用下列方法克隆入载体： 直接与载体连接； 平头两端分别加同聚物尾。 加人工接头引入酶切位点； 注意：加接头前，先将DNA甲基化 第六十九页，共一百三十八页。 使用PCR法扩增目的基因的前提：已知目的基因全序列或两侧序列，通过合成与模板互补的上下游引物，扩增目的基因。 由Taq DNA聚合酶扩增的PCR产物，3’端总是带有一个非模板依赖型的突出碱基--A，可用T载体克隆。 4、PCR法扩增目的基因 第七十页，共一百三十八页。 基因文库（gene library or gene bank）： 从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆形式存在。 基因组文库（含全部基因） cDNA文库（含全部蛋白质编码的结构基因） 5、通过构建基因文库分离目的基因 根据构建方法的不同，基因文库分为： 第七十一页，共一百三十八页。 将某种生物基因组DNA经超声波处理或适当的限制酶部分酶切后，与载体DNA重组，全部转化宿主细胞，得到含全部遗传信息的克隆群，称为基因组文库。 基因组文库： 注意：从真核基因组DNA文库所分离的基因含内含子序列，不能直接在原核细胞中表达。 第七十二页，共一百三十八页。 将某种细胞的全部mRNA通过逆转录合成cDNA，然后与载体DNA重组，转化宿主细胞，得到含全部表达基因的克隆群，称为cDNA文库，具有组织细胞特异性。 cDNA文库： 第七十三页，共一百三十八页。 绝大多数真核生物mRNA10 kb，cDNA文库构建的载体常选质粒； 基因组文库构建的载体常选?-DNA或cos质粒； 对于动植物和人类基因组，使用YAC或BAC载体。 几种载体的最大装载量比较： 质粒 15 kb ?-DNA 25 kb cos质粒 45 kb BAC 300 kb YAC 400 kb 第七十四页，共一百三十八页。 基因组DNA的制备： 为最大限度地保证基因在克隆过程中的完整性， 基因组DNA在分离纯化操作中应避免过度断裂。 基因组文库构建的技术性问题： 常规方法制备的染色体DNA长度100kb左右，如先将细胞固定在低融点凝胶中，再置于含SDS、蛋白酶K、RNase的缓冲液中浸泡，可获得1000 kb的DNA片段。 第七十五页，共一百三十八页。 基因组DNA的切割：