56℃水浴灭活处理含胍盐保存液的咽拭子样本对乌鲁木齐地区新型冠状病毒核酸检测结果的影响.docxVIP

? ? 56℃水浴灭活处理含胍盐保存液的咽拭子样本对乌鲁木齐地区2019新型冠状病毒核酸检测结果的影响 ? ? [Summary]：目的：探讨56℃水浴灭活处理含胍盐保存液的咽拭子样本对乌鲁木齐地区2019新型冠状病毒核酸检测结果的影响。方法：使用含胍盐保存液的样本管收集新疆乌鲁木齐地区2020年7-8月2019新型冠状病毒肺炎恢复期患者咽拭子样本170例。将170例样本等量提取双份并分组：试验组：56℃恒温水浴孵化30分钟处理后提取核酸；对照组：室温放置30分钟后提取核酸。对上述两组核酸提取物进行实时荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR）检测，分别检测N、ORF1ab和人体上皮细胞（ribonucleoprotein，RNP)基因（试剂内标基因)，用循环阈值（Ct）评价检验结果。阳性样本：检测样本在FAM和VIC通道Ct值≤40且有明显的扩增曲线；阴性样本：检测样本在FAM和VIC通道无扩增曲线或Ct值＞40。结果：1.对照组阳性标本检出率显著高于经56℃水浴灭活处理的试验组，差异具有统计学意义（P＜0.05）；2.两组样本人体上皮细胞RNP基因均呈现明显典型的扩增信号；3.对照组结果分析：46例阳性标本中，单N基因阳性32例，N基因和ORF1ab基因同时阳性14例；未见VIC通道检测ORF1ab单基因阳性；4.试验组结果分析：单N基因阳性14例，N基因和ORF1ab基因同时阳性结果9例；经56℃水浴灭活处理的咽拭子标本，N基因由阳变阴的标本23例（占比50%），ORF1ab基因由阳变阴的标本6例（占比42.86%）；受到干扰的样本Ct值均在36以上，即反应体系中起始模板量较低的样本（通常认为是弱阳性标本/灰区标本）。结论：新疆乌鲁木齐地区2020年7-8月含胍盐保存液的咽拭子样本经56℃水浴灭活处理30分钟后，2019新型冠状病毒核酸降解，FAM通道检测的N基因及VIC通道检测的ORF1ab基因Ct值升高，造成假阴性结果增多。 Keys：2019新型冠状病毒（2019-nCoV）；咽拭子；病毒灭活；实时荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR）； ：R373.1 ：A 中华医学会检验分会发布的《2019新型冠状病毒肺炎临床实验室生物安全防护专家共识》[1]及国家卫建委发布的《新型冠状病毒实验室生物安全指南（第二版）》[2]中均指出，2019-nCoV进行核酸扩增前必须先对标本进行灭活。目前已有研究表明以RT-PCR为主要检测手段的阳性率仅有30%-50%左右；除感染者病毒复制率低、咽拭子标本采样不合格原因外，张沁欣、段秀枝等人研究显示，核酸检测前56℃水浴灭活病毒的步骤极有可能显著降低可检出病毒核酸模板量，进而造成低浓度样本假阴性率升高[3-4]；姜蕾等研究表明56℃灭活30分钟和胍盐RNA保存液两种灭活方式对2019新型冠状病毒核酸荧光定量PCR结果无影响[5]。目前乌鲁木齐地区多数检测机构的样本采集管均含胍盐保存液，对于含胍盐保存液的咽拭子样本是否需要进一步高温灭活的意见未统一。尚无研究表明含胍盐保存液的咽拭子样本经高温水浴灭活处理后是否对检验结果产生影响。为保证检验结果的一致性，实现检验结果互认，本研究特此展开。 1.资料与方法 1.1 一般资料：使用含胍盐保存液的样本管收集新疆乌鲁木齐地区2020年7-8月2019新型冠状病毒肺炎恢复期患者咽拭子样本170例，注意避免紫外光直接照射、酒精及含氯消毒剂的喷洒。 1.2仪器与试剂：咽拭子标本采集及样本保存管：百康芯（含胍盐保存液的样本管）；核酸提取设备：重庆中元EXM3000核酸提取仪及其配套的磁珠法核酸提取试剂；核酸扩增仪：华大基因MA-6000；核酸扩增试剂：中山大学达安基因股份有限公司生产的新型冠状病毒2019nCoV核酸检测试剂盒（荧光PCR法）。恒温水浴箱：培英水浴箱。 1.3方法 1.3.1 标本采样：根据《医疗机构新型冠状病毒核酸检测工作手册（试行）》版规定，选择经过生物安全培训（培训合格）的医护人员进行咽拭子标本采集工作。在患者两侧咽扁桃体稍用力来回擦拭3次及以上，咽后壁上下擦拭3次及以上，将拭子头浸入含有2-3ml病毒保存液的样本管内保存，做好密闭。 1.3.2 分组及处理：将170例标本等量提取双份并分组：试验组：56℃恒温水浴孵化30分钟处理后提取核酸；对照组：室温放置30分钟后提取核酸。 1.3.3 核酸提取采用重庆中元EXM3000核酸提取仪及其配套的磁珠法核酸提取试剂，向反应孔内加入200μl咽拭子洗脱液，磁性颗粒吸附核酸（DNA/RNA）多聚基团，在高盐等特殊条件下释放核酸，通过吸附、分离等一系列改变液相条件下最终实现分离核酸，提取的病毒核酸立即使用。 1.3.4 核酸扩增：荧光RT-PCR检测使用中山大学达安基因股份有限公司生产的新型冠