基因操作原理.pptxVIP

基因操作原理;将外源DNA或基因携带入宿主细胞（host cell）的工具称为载体;利用重组DNA技术分离目的基因，称之为基因克隆;载体的类型： 质粒plasmid 噬菌体phage 粘粒载体cosmid 噬菌粒phagemid;一 、质粒的基本特性;复制子有不同的组成方式（滚环、?、以及G+/G-） 在Ecoli中，使用的大多数载体都带有一个来源于pMB1质粒或ColE1质粒的复制子其复制方式如下： ;合成RNAII即前引物，形成杂交体 RNaseH 切割RNAII 使之成熟，形成三叶草结构 RNAI 可控制RNAII形成二级结构 Rop增强RNAI的作用;;pMB1质粒的复制并不需要质粒编码的功能蛋白，而是完全依靠宿主提供的半衰期较长的酶（DNA聚合酶I，DNA聚合酶III），依赖于DNA的RNA聚合酶，以及宿主基因dnaB,dnaC,dnaD和danZ的产物, 因此，即使蛋白质合成并非正在进行，复制依然能够我行我素;3．质粒的不相容性 两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性 在第二个质粒导入后，在不涉及DNA限制系统时，不相容的质粒一般为利用同一复制系统，质粒分配到子细胞时会发生竞争，随机挑选，微小差异，最终放大。 不相容群：指那些具有不相容性的质粒组成的一个群体，一般具有相同的复制子ColE1/pMB1 现已发现30多个不相容群，ColE1/pMB1 pSC101, p15A;4．转移性 在自然条件下，很多质粒可以通过称为细菌接合的作用转移到新宿主内 要素：移动基因mob，转移基因tra，转移起始位点 如：F’质粒 pBR322有起始位点bom的nic位点，可在第三个质粒（如ColK）编码的转移蛋白作用下，通过接合性质粒来进行转移。但大多数载体无nic/bom位点（pUC） ;1. 选择标记 用于鉴别目标DNA的存在， 将成功转化了质粒的宿主挑选出来;青霉素是一类化合物的总称，其分子结构由侧链R-CO-和主核6-氨基青霉烷酸（6-APA）两部分组成。在6-APA中有一个孢和的噻噬环（A）和一个?-内酰胺环，6-APA由L-半脱氨酸和缬氨酸缩合成的二肽;(3) 氯霉素抗性基因 chloramphenicol, Cmr or Cat Cm与核糖体50S亚基结合并抑制蛋白质合成 目前使用的Cmr来源于转导性P1噬菌体(也携带 Tn9) cat基因编码一个四聚体细胞质蛋白(每个亚基23kDa)，氯霉素乙酰转移酶，在乙酰辅酶A存在的条件下，催化???霉素羟乙酰氧基衍生物的形成，该产物不能与核糖体结合;(4) 卡那霉素和新霉素抗性基因 kanamycin/neomycin 可与核糖体成分相结合并抑制蛋白质合成的脱氧链霉胺氮基糖苷 这两种抗生素可被氨基糖苷磷酸转移酶（APH(3’)-II）所灭活，该酶为25kDa，似乎位于外周质腔，这些抗生素的磷酸化干扰了它们向细胞内的主动转移。 ;(5) Sup F 琥珀突变抑制基因 终止密码：UAA(赭石), UAG(琥珀), UGA(乳白), supF编码细菌的抑制性tRNA 在某一宿主中含具琥珀突变的tetr 和ampr，只有当含supF的质粒转入后，宿主才会对Amp和tet具抗性，supF在UAG上加入酪氨酸，supE加入谷氨酰氨 如 ? AN13 , 0.895kb;2. 筛选标记;IPTG:异丙基-?-D-硫代半乳糖苷 诱导物 X- gal: 5-溴-4氯-3吲哚-?-D-半乳糖苷 底物 (生色剂);;在载体中加入一个短区段，含LacZ基因的调控区和头140个aa的编码信息，在这个编码区中插入了一个多克隆位点，它并不破坏阅读框架，相当于在?-半乳糖苷酶的氨基端插入了几个氨基酸，而不影响未加几个氨基酸时的功能。 lacz?M15 编码缺失第11-41位氨基酸的?-半乳糖苷酶，但无酶学活性。 ;?-互补 lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的?-半乳糖苷酶阴性的突变体之间实现互补;(2) 插入失活;三、质粒载体的种类 ① pBR322之前 pSC101,ColE1等, 大且酶切位点少 转化效率与大小成反比 15kb 转化效率成为限制因素 质粒越大，越难于用限制酶切因素进行鉴定 质粒越大，拷贝数就越低;② pBR322以后，调整载体的结构，提高载体的效率 pBR322 pUC质粒 去掉多余片段，提供多克隆位点，筛选标记 ③ 增加辅助功能/表达载体，穿梭载体;1．克隆载体 用于扩增or 保存DNA片段，最简单的载体 ① pBR322 4361bp， 许多质粒载体由