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实验二培养材料消毒和接种 第一页，共二十五页，2022年，8月28日 一、实验目的 1、掌握植物组织培养中的无菌操作技术 2、掌握植物外植体表面消毒的常规方法 第二页，共二十五页，2022年，8月28日 操作前的准备工作 接种室在接种前4-5 d必须通风换气。在接种前一天对接种室进行全面消毒，一般用40%福尔马林进行全面喷雾，并密闭24 h，然后打开换气窗10-15 min.。 第三页，共二十五页，2022年，8月28日 A: 实验器具和材料的准备B: 用75%的酒精擦拭超净工作台，然后室内及超净工作台用紫外灯杀菌20min-30min。注意：台面上的用品不要放置太多或重叠放置，以免降低灭菌效果。C: 关紫外灯、打开风机，过5-10min进入缓冲间，以75%洗手和手臂，更换无菌服、帽子和口罩。进入接种室。（注：没有特别情况，尽量不要下工作台） 第四页，共二十五页，2022年，8月28日 D: 用70－75％乙醇消毒双手。试验用具也应该用酒精消毒。点燃酒精灯，将金属器械在其火焰上灼烧，冷却待用。注意：所有操作应在火焰近处并经过灼烧进行。移液管不能灼烧，培养瓶口、塑料材料、橡胶材料过火焰不能时间太长。 第五页，共二十五页，2022年，8月28日 接种时在近火焰处打开瓶口，使瓶倾斜，以免空气中微生物落入瓶中 错 误 第六页，共二十五页，2022年，8月28日 整个接种操作应在近火焰处进行，且动作要迅速 正 确 错 误 第七页，共二十五页，2022年，8月28日 接种过程中尽可能达到悬空要求 防止操作带来的污染 正 确 错 误 第八页，共二十五页，2022年，8月28日 培养器材的清洗与灭菌 在细胞工程实验中，离体细胞对任何毒性物质都十分敏感。毒性物质包括解体的微生物和细胞残余物以及非营养的化学物质。某些化学物质仅0.01μg/L就会对细胞产生毒性作用，因此对培养器皿的清洗是组织培养中一项极为重要的环节。 第九页，共二十五页，2022年，8月28日 A、新购买的玻璃仪器表面常附着有游离的碱性物质，可先用0.5％的去污剂洗刷，再用自来水洗净，然后浸泡在1％～2％盐酸溶液中过夜（不可少于四小时），再用自来水冲洗，最后用无离子水冲洗两次，在100℃～120℃烘箱内烘干备用。 第十页，共二十五页，2022年，8月28日 B、使用过的玻璃仪器的清洗 先用自来水洗刷至无污物，再用合适的毛刷沾去污剂（粉）洗刷，然后用自来水彻底洗净去污剂，用无离子水洗两次，烘干备用。 清洗后器皿内外不可挂有水珠，否则重洗. C、金属用品洗涤  金属用品一般不宜用各种洗涤液洗涤（新的可以用热洗衣粉水洗净），需要清洗时，一般用酒精擦洗，然后火焰干燥 第十一页，共二十五页，2022年，8月28日 （1）干热灭菌适用于玻璃器皿和金属器械的灭菌。操作方法：150℃ 、40min （2）湿热灭菌适用于各种器皿、培养基、器皿、蒸馏水、棉塞、纸等。121℃ 维持20~30min 第十二页，共二十五页，2022年，8月28日 （3）过滤灭菌 培养基中某些成分遇到高温分解（如某些生长调节剂GA3、玉米素等），就需要过滤灭菌。 灭菌方法：将生长调节剂或酶配成一定浓度，用注射器注入微孔滤膜虑。制培养基时，现将培养基高压灭菌，待降至50℃左右时，加入适量的激素。 第十三页，共二十五页，2022年，8月28日 （4）射线灭菌主要是利用紫外灯进行照射，适合实验室空气、操作台等，灭菌时间20-30min。注意：关灯后5min后再进入。超净工作台关灯后要打开风机 、 （5）火焰灼烧灭菌用火焰灼烧达到灭菌目的，适用于接种器皿的灭菌。 第十四页，共二十五页，2022年，8月28日 （6）消毒剂适用外植体、实验器皿、操作表面、皮肤等。几种常用消毒剂的效果比较 消 毒 剂 使用浓度(%) 消毒时间(min.) 效 果 残液去除难易 乙醇 70-75 0.1-3 好 易 新洁尔灭 10～20 5～30 好 易 氯化汞 0.1～1 2～15 最好 最难 过氧化氢 10～12 5～15 较好 最易 抗菌素 4～50mgl-1 30～60 较好 较难 次氯酸钙/纳 9 ～ 10 5～30 好 易 第十五页，共二十五页，2022年，8月28日 二、实验原理 用于进行组织培养的组织、器官和细胞称为外植体。在组织培养中，外植体如果是带菌的，在接种前都必须进行表面消毒，这是取得培