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生物化学实验原理与方法第1页/共151页 25 六月 2023第一章：生物化学物质的制备第二章：离心技术第三章：层析技术第四章：电泳技术第五章：基因克隆技术第六章：PCR技术第七章：生物芯片技术第2页/共151页 25 六月 2023第一章:生化物质的制备 生化物质通常是指动物、植物和微生物进行新陈代谢时产生的蛋白质（包括酶）和核酸等有机化合物。这些大分子物质在生物体内具有各种生理活性，这些活性的产生与其结构有着密切关系，因此，分离此类物质不能用一般的化学分离方法，而是采用比较特殊的方法。这些方法与一般的化学分离方法相比，有下列几个特点：1、生物材料组成非常复杂。其中包括数百种甚至数千种化合物，并且在分离过程中，这些化合物仍在发生代谢变化，如蛋白质和核酸的水解。2、有些化合物的含量极微，如激素等。3、许多具有生物活性的物质一旦离开活体，很易变变性破坏，因此常选用比较温和的条件进行制备。4、生化分离制备几乎都在溶液中进行，影响因素很多，实验方法经验性较强。第3页/共151页 25 六月 2023第一节：生物材料的选择选择生物材料的原则：有效成分含量多，稳定性好；来源丰富，保持新鲜；提取方法简单；有综合利用价值等。生物材料一般可以分为两大类：天然生物材料和人工生物材料。天然生物材料一般是指在自然界易采集的、目的物含量较高的生物个体、器官或组织。人工生物材料又分为三种： 1、 新品种材料 2、组织培养材料 3、生物产品与生物制品材料第4页/共151页 25 六月 2023第二 节：细胞及组织的破碎细胞及组织破碎的方法多种多样，根据实验目的和材料的不同可以采用不同的 细胞破碎方法，细胞破碎方法大致可以分为四类：机械破碎： 研磨法；组织捣碎法；超声波法；压榨法；冻融法溶胀和自溶 溶胀：细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液如低浓度的稀盐溶液中，由于存在渗透压差，溶剂分子大量进入细胞，引起细胞膜发生胀破的现象。 自溶：细胞结构在本身所具有的各种水解酶如蛋白酶和酯酶等作用，发生溶解的现象。化学处理 用脂溶性的溶剂（如丙酮、氯仿、甲苯）或表面活性剂（SDS）处理细胞时，可以把细胞壁、细胞膜的结构部分溶解，进而使细胞释放出各种酶类物质，并导致整个细胞破碎。生物酶降解 生物酶有降解细菌细胞壁的功能，在用此法处理细胞时，先是细胞壁降解，随之而来的是因渗透压差引起的细胞膜破裂，最后导致细胞完全破碎。第5页/共151页 25 六月 2023第三节：生物分子的提取提取是在分离纯化前期，将样品研磨，把被破碎的细胞置于一定的溶剂（提取液）中，使某一类分子目的物释放到提取液中的过程。提取液应具备的条件：对有效成分溶解度大，破坏作用小；对杂质溶解度小或不溶解；来源广泛、价格低廉、操作安全等。生物分子可以分为生物大分子和生物小分子。生物小分子的结构由较强的共价键决定；生物大分子中除共价键外，还含有较弱的共价键和次级键，故需温和的条件才能保证生物大分子的活性不被破坏。因此，这两类生物分子的提取液成分和操作条件差别很大。1、生物小分子的提取2、生物大分子的提取 蛋白质和酶的提取 核酸的提取第6页/共151页 25 六月 2023溶剂提取法原理:利用溶剂的溶解作用把所需物质从细胞中转移出来影响溶剂提取效率的因素（影响溶解度的的因素） 1、溶剂的性质：（根据相似相溶原理） 2、离子强度：离子强度是影响物质溶解度的主要因素，但离子强度对不同物质溶解度的影响不同，如高离子强度下DNA-核蛋白溶解度增加，而低离子强度下RNA-核蛋白溶解度增加；绝大多数蛋白质和酶，在稀盐溶液中溶解度增加（盐溶）。 3、PH值：溶剂的PH值影响溶质分子的解离状态，离子状态的物质，不能是阳离子还是阴离子都易溶于水，而非离子状态的物质易溶于有机溶剂。 4、温度：温度的升高可以增加物质的溶解度。 5、去垢剂：去垢剂是一类既有亲水基又有疏水基的物质，可以分为阴离子、阳离子和中性去垢剂等，如SDS，Tween20，Triton X-100。第7页/共151页 25 六月 2023第8页/共151页 25 六月 2023第四节：生物大分子的浓缩1、沉淀法:在提取液中加入适量的中性盐或有机溶剂，使有效的成分变为沉淀，经过离心或过滤收集的沉淀物，加少量缓冲液溶解后，在经离心出去不溶物，获得的上清液通过透析或凝胶过滤脱盐。 盐析法；有机溶剂沉淀法；等电点沉淀法；非离子多聚体沉淀法；生成盐复合物沉淀法；热变性沉淀法；酸碱变性沉淀法等 。