基因工程基因克隆的工具酶.pptxVIP

基因工程基因克隆的工具酶;从核酸分子的末端开始，一个核苷酸一个核苷酸地消化降解多核苷酸链，叫做核酸外切酶（exonuclease）;从核酸分子内部切割磷酸二酯键使之断裂形成小片段，叫做核酸内切酶（endonuclease）;第4页/共85页;1　限制性核酸内切酶(restriction enzyme) ;　　一类能从DNA分子中间水解磷酸二酯键,从而切断双链DNA的核酸水解酶。它们不同于一般的脱氧核糖核酸酶（DNase），它们的切点大多很严格，要求专一的核苷酸顺序─识别顺序。 ;1.1　寄主控制与修饰现象(Restriction and modification );在Ecoli.K上生长的λ噬体则表示为λ（K）。 实验表明，用这种λ（K）噬菌体感染Ecoli. B，形成噬菌斑的效率就很低 因此λ（K）噬菌体受到了B菌体的限制。 ;第9页/共85页;Modification, DNA methylation, is the mechanism by which the host bacteria protects its own DNA from cleavage by the restriction endonuclease. A modification methyltransferase methylates the DNA at the same recognition sequence that the restriction endonuclease uses to bind to the DNA prior to cleavage. This activity discriminates self DNA from foreign DNA.? ;In vivo restriction of bacteriophage lambda by two different restriction systems.?;1.2　限制性内切酶的种类;不兼有甲基化酶的活性，细胞内另有独立的甲基化酶。 它切断DNA时不需ATP，也不需SAM。 它的切点是严格的，而且就在识别顺序之中。;第14页/共85页;1.3　限制性核酸内切酶的命名;EcoRⅠ　Escherichia coli（大肠杆菌） RY13之酶Ⅰ HindⅢ　Haemophilius influenzae（嗜血流感杆菌） Rd之酶Ⅲ AluⅠ Arthrobacter luteus（藤黄节杆菌 ） 之酶Ⅰ HaeⅢ　Haemophilus aegyptius（埃及嗜血菌） 之酶Ⅲ;?在DNA分子双链的特异性识别序列部位，切割DNA分子产生链的断裂;识别双链DNA分子中4 - 8对碱基的特定序列;EcoRI等产生的5′粘性末端;PstI等产生的3′粘性末端;PvuII等产生的平头末端;1.5　同裂酶和同尾酶;Sau3AⅠ和BamHⅠ同尾酶所形成的杂种位点对Sau3AⅠ敏感，但不是BamHⅠ的识别位点识别;第24页/共85页;1.6　限制片段末端的连接作用;由同一片段的2个互补末端之间的碱基配对而形成的环形分子。 ;1.7 大部分II 型核酸内切酶需要相似的反应条件;1.8 影响核酸内切限制酶活性的因素 ;②　DNA样品的甲基化程??;③　酶切消化反应温度;④　DNA的分子结构;⑤　核酸内切限制酶的缓冲液;缓冲液Tris-HCl的作用在于使反应混合物的pH恒定在酶活性所要求的最佳数值的范围之内。对绝大多数限制酶来说，在pH=7.4的条件下，其功能最佳。;有一部分核酸内切限制酶对于钠离子或钾离子浓度变化反应十分敏感 而另一部分核酸内切限制酶则可适应较广的离子强度的变化幅度;高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的星号活性（Star activity）现象 ;不同的酶生产厂家适合各种不同反应的缓冲液;Takara;缓冲液成份(1x)： NEBuffer 1 (黄色)：10 mM Bis Tris 丙烷-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT (pH 7.0 25°C)。 NEBuffer 2 (蓝色)： 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 1 mM DTT (pH 7.9 25°C)。 NEBuffer 3 (红色)： 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 1 mM DTT (pH 7.9 25°C)。 NEBuffer 4 (绿色)： 20 mM Tris-Ac, 10 mM Mg（Ac）2, 50 mM KAc, 1 mM DTT (pH 7.9 25°C)。;NEB稀释缓冲液成份：稀释液