第三章细胞生物学研究方法1.pptVIP

多糖的显示方法 PAS（过碘酸希夫氏）反应 利用过碘酸的强氧化作用破坏糖分子的C-C键，使糖分子氧化产生双醛基，自由的醛基与希夫试剂作用形成紫红色产物。 当前第61页\共有90页\编于星期五\21点 脂类物质的显示方法 对脂类物质的染色应用的是物理的扩散原理。苏丹类染料是脂溶性染剂，它溶于酒精但更易溶于脂肪，所以当含有脂肪的标本与苏丹染料接触时，它会脱离酒精而溶于脂类结构中从而显色。 当前第62页\共有90页\编于星期五\21点 细胞中各种酶的显示方法 由于酶易受外界条件影响而变性失活。 对酶的显示一般采取间接的方法进行，对可以与酶发生特异性结合的底物进行染色从而达到显示酶的目的。 在实验的过程中需在尽量保持酶的活性。 当前第63页\共有90页\编于星期五\21点 包埋和切片 样品制备的第二步是将固定的组织制备成切片。 样品首先要被包埋在介质中，通常用液态的石蜡或树脂做包埋剂，使之渗入整块组织，然后将之硬化成固体的包埋块； 用专门的切片机切割包埋块，制备成薄切片。适用于光学显微镜观察的切片厚度为 l-10μm。 当前第29页\共有90页\编于星期五\21点 当前第30页\共有90页\编于星期五\21点 染色(staining) 大多数细胞总重量的70%是水，对可见光几乎是透明的，只有很少的内含物不透光。染色的目的就是给细胞的不同组分带上可区别的颜色特征。 19世纪初，发现某些有机染料可染生物组织，并对细胞特殊部位的着色具有选择性。如苏木精对负电荷分子有亲和性，能显示出细胞内核酸的分布；酸性染料如伊红可使细胞质染色；苏丹染料在脂肪中的溶解度比在乙醇中大，所以苏丹染料的乙醇饱和溶液能使脂肪着色。但对许多染料的特异性染色机理尚不清楚。? 当前第31页\共有90页\编于星期五\21点 激光共焦扫描显微镜技术（Laser Scanning Confocal Microscopy） ?原理 ?应用： 排除焦平面以外光的干扰，增强 图像反差和提高分辨率(1.4—1.7)， 可重构样品的三维结构。 当前第32页\共有90页\编于星期五\21点 当前第33页\共有90页\编于星期五\21点 2、电子显微镜技术 自从第一台电子显微镜在德国诞生以来，取得飞跃发展并在生物学领域中得到广泛的应用。 利用电镜可以观察到各种病毒的形态结构以及细胞器的微细结构，还能观察到许多生物大分子。 目前的电镜已由单纯的形态描述进入了成分分析、定性和定量分析。 此外，将电镜与计算机连用，对图象进行信息处理也取得了很大进展。 总之，电镜已成为研究生物学的有力工具，必将发挥越来越大的作用。 当前第34页\共有90页\编于星期五\21点 1932年德国学者Max Knolls和Ernst Ruska发明了第一台电子显微镜，开拓了超微世界，发现了许多光镜下看不到的结构，如细胞膜、线粒体、细胞核、高尔基体、中心粒等细胞器的细微结构。 将在光学显微镜中观察不到而只能在电子显微镜下观察的结构称为亚显微结构(submicroscope structure)， 或超微结构(ultrastructure)。 在种类上，电镜可分为两大类:透射电子显微镜和扫描电子显微镜。 当前第35页\共有90页\编于星期五\21点 电镜与光镜的比较 显微镜 分辨本领 光源 透镜 真空 成像原理 LM TEM 200nm 100nm 0.1nm 可见光（400-700） 紫外光 （约200nm) 电子束 （0.01-0.9） 玻璃透镜 玻璃透镜 电磁透镜 不要求真空 不要求真空 要求真空 1.33x10-5～1.33x10-3Pa 利用样品对光的吸收形成明暗反差和颜色变化 利用样品对电子的散射和透射形成明暗反差 光镜与电镜的主要区别： （1）光源不同：光镜为可见光或紫外线；电镜为电子束 （2）透镜不同 ：光镜为玻璃；电镜为电磁透镜 （3）真空 （4）显示记录系统 当前第36页\共有90页\编于星期五\21点 透射电子显微镜(TEM) 透射电子显微镜主要是让电子束穿透样片而成像。电子显微镜基本结构由三大部分组成∶电子光学系统(镜筒)、真空系统、电子学系统(供电系统)。 电子光学系统由照明系统、样品室、成像系统、观察窗和记录用的照相机等组成。 由于电子显微镜必需在高度真空条件下进行工作，阴极与阳极之间会放电， 灯丝也会因受到氧化或被阳离子轰击而缩短寿命，所以设计了真空系统。 电子学系统即供电系统，需要高压稳压。 当前第37页\共有90页\编于星期五\21点 电镜(透射电镜)与光镜光路图比较 当前第38页\共有90页\编于星期五\21点 电子显微镜的基本构造 当前第39页\共有90页\编于