蛋白质的研究方法与原理.pptVIP

2. 质谱法 质谱技术－－基于串联质谱技术的氨基酸测序方法是根据质谱技术测定多肽分子质量的极高准确性这一特点而设计的 。 ①先测定某一肽段（如：A-B- C-D-E-F-G-- ）以及从C-末端或N-末端去除一个残基的同一肽段（如：B-C-D-E-F-G-）各自的分子质量，二者之差值即为末端残基（A）的分子质量。 ②然后与20种标准氨基酸的分子量进行比较就可以确定末端氨基酸的本质了。 测定时： 当前第62页\共有121页\编于星期六\11点 实际操作时： 从质谱上得到的是一系列的多肽片段，每对大小相近的片段之间仅仅相差一个氨基酸残基。 根据这一分子量差值的大小，较大肽段的末端残基即可准确判断。换句话说，从获得的一系列依次相差一个残基的肽段的分子质量中我们很快就可以确定最初样品多肽的末端序列（从N一末端或C一末端开始）。 当前第63页\共有121页\编于星期六\11点 二、蛋白质空间结构分析 （一）X射线衍射晶体分析法 （二）核磁共振法 （三）圆二色谱法 （四）傅里叶变换红外光谱法 （五）生物信息学预测蛋白质空间结构 当前第64页\共有121页\编于星期六\11点 （一）X射线衍射晶体分析法 当前第65页\共有121页\编于星期六\11点 X射线本质 X射线是一种短波长(0.005～10nm)、高能量(2.5×105 ～1.2×102eV)的电磁波。它是原子内层电子在高速运动电子流冲击下，产生跃迁而发射的电磁辐射。 当前第66页\共有121页\编于星期六\11点 X-射线晶体结构分析基本原理 X射线衍射分析所依赖的基本原理是X射线衍射现象 X射线衍射现象利用X射线的波长和晶体中原子的大小及原子间距同数量级的特性来分析晶体结构。 当X射线入射到样品晶体分子上时，分子上的每个原子使X射线发生散射，这些散射波之间相互叠加形成衍射图形。 衍射图形能给出样品内部结构的许多资料，如原子间的距离、键角，分子的立体结构、绝对构型、原子和分子的堆积、有序或无序的排列等。 当前第67页\共有121页\编于星期六\11点 （二）核磁共振法 1946年美国斯坦福大学的F.Bloch和哈佛大学的两个研究小组首次独立观察到核磁共振现象，为此他们两人获1952年诺贝尔物理奖。 1983年，瑞士科学家Kurt Wüthrich教授实验室首次运用核磁共振方法解析了胰高血糖素（glucagon）多肽的溶液构象. 发明了利用核磁共振(NMR)技术测定溶液中生物大分子三维结构的方法获得了2002年度诺贝尔化学奖 当前第68页\共有121页\编于星期六\11点 NMR基本原理 核磁共振(Nuclear Magnetic Resonance)， 就是处于某个静磁场中的自旋核系统受到相应频率的射频磁场作用时 ,共振吸收某一特定频率的射频辐射的物理过程。 核磁共振波谱是测量原子核对射频辐射(约4?600MHz)的吸收，这种吸收只有在高磁场中才能产生。 核磁共振波谱仪 当前第69页\共有121页\编于星期六\11点 核磁共振法中几个常用的参数 化学位移 耦合常数 NOE（核欧沃豪斯效应）信号强度 谱峰面积 弛豫时间 当前第70页\共有121页\编于星期六\11点 （1）化学位移 δ 值越大，表示屏蔽作用越小，吸收峰出现在低场；δ 值越小，表示屏蔽作用越大，吸收峰出现在高场。 当前第71页\共有121页\编于星期六\11点 （2）耦合常数 核与核之间以价电子为媒介相互耦合引起谱线分裂的现象称为自旋裂分。由于自旋裂分形成的多重峰中相邻两峰之间的距离被称为自旋－自旋耦合常数,用J表示。耦合常数用来表征两核之间耦合作用的大小。 J耦合常数大小主要与连接两个核的化学键数目有关，与影响标量耦合核之间电子云分布的因素有关。 当前第72页\共有121页\编于星期六\11点 （3）NOE信号强度 当分子内有两个空间距离小于0.5nm的原子核时，如果用双共振法照射其中一个核，使干扰场的强度增加到刚使被干扰的谱线达到饱和，则另一个靠近的原子核的共振信号就会增加，这种现象称核欧沃豪斯效应 （NOE）。 当前第73页\共有121页\编于星期六\11点 （4）谱峰面积 谱峰面积和分子中同一化学环境的原子核数目的多少成正比，因此峰面积的积分值可用来做定量分析的基础。 当前第74页\共有121页\编于星期六\11点 （5）弛豫时间 原子核从激化的状态回复到平衡排列状态的过程叫弛豫过程。它所需的时间叫弛豫时间。 自旋晶格弛豫：处于高能态的氢核，把能量转给周围的分子，回到低能态。 自旋-自旋弛豫 ：两个进动频率相同，进动取向不同的磁性核，在一定距离内时，它们相互交换能量，改变进动方向。 当前第