微生物检验操作.docxVIP

微生物操作步骤 培养皿、移液管用干燥箱180℃ 120分钟干热灭菌，试管、三角烧瓶、平板计数琼脂用、生理盐水高压灭菌锅 121℃ 15分钟湿热灭菌。 生理盐水配制：称取8.5g氯化钠于1000mL蒸馏水中 培养基配制：按平板计数培养基说明书配制 平板计数琼脂放在46 ℃水浴锅内恒温。 1:10 1:100 1:1000三个稀释度 以无菌吸管吸取25 mL样品置盛有225 mL生理盐水的无菌锥形瓶中，充分混匀，制成1：10 的样品匀液。 用1 mL无菌吸管吸取1：10 样品匀液1 mL，沿管壁缓慢注于盛有9 mL稀释液的无菌试管中，振摇试管使其混合均匀，制成1：100的样品匀液。 制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用一次1 mL无菌吸管。 根据对样品污染状况的估计，选择2 个~3 个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液）, 在进行10 倍递增稀释时，每个稀释度分别吸取1 mL样品匀液加人两个无菌平皿内。同时分别取1 mL稀释液加人两个无菌平皿作空白对照。 及时将15 mL~20 mL冷却至46 ℃的平板计数琼脂培养基（可放置于46 ℃±1 ℃ 恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。 琼脂凝固后，将平板翻转，36 ℃±1 ℃ 培养48h±2h 。 可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（colony - forming units , CFU ）表示。 结果的表述 菌落总数的计算方法 若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每克（或毫升）中菌落总数结果。 若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按式（l ）计算： N=∑C/（n1+0.1n2）d……………………（1 ) 式中： N ― 样品中菌落数； ∑C ― 平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和； nl ― 第一个适宜稀释度平板上的菌落数； n2 ― 第二个适宜稀释度平板上的菌落数； d ― 稀释因子（第一稀释度）。 6.4大肠菌群2010 培养基配制：按月桂基蛋白胨说明书配制 以无菌吸管吸取25ml样品，置盛有225ml生理盐水的无菌锥形瓶中，充分棍匀，制成1:10 的样品匀液。用1mL无菌吸管吸取1:10 样品匀液1ml，沿管壁缓缓注人9ml生理盐水的无菌试管中， 振摇试管使其混合均匀，制成1:100 的样品匀液。根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成10 倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1 次，换用1支1ml无菌吸管或吸头。初发酵试验每个样品，选择3 个适宜的连续稀释度的样品匀液（ 液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3 管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL, 36℃±1℃ 培养24h±2h ，观察倒管内是否有气泡产生，如未产气则继续培养至48h±2h 。记录在24h 和48h 内产气的LST 肉汤管数。未产气者为 大肠菌群阴性，产气者则进行复发酵试验。复发酵试验用接种环从所有48h±2h 内发酵产气的LST 肉汤管中分别取培养物l环，移种于煌绿乳糖胆盐( BGLB）肉汤管中，36℃±1℃ 培养48h±2h ，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。 大肠菌群最可能数（MPN ）的报告根据 大肠菌群阳性管数，检索MPN 表，报告每克（或毫升）样品中 大肠菌群的MPN 值。 6.5大肠菌群2003 培养基配制：乳糖胆盐发酵管说明书配制 以无菌吸管吸取25ml样品，置盛有225ml生理盐水的无菌锥形瓶中，充分棍匀，制成1:10 的样品匀液。用1mL无菌吸管吸取1:10 样品匀液1ml，沿管壁缓缓注人9ml生理盐水的无菌试管中， 振摇试管使其混合均匀，制成1:100 的样品匀液。根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成10 倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1 次，换用1支1ml无菌吸管或吸头。初发酵试验每个样品，选择3 个适宜的连续稀释度的样品匀液（ 液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3 管乳糖胆盐发酵管，每管接种1mL, 36℃±1℃ 培养24h±2h ，观察倒管内是否有气泡产生，如未产气则继续培养至48h±2h 。记录在24h 和48h 内产气的管数。未产气者为 大肠菌群阴性，产气者则进行复发酵试验。分离培养将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置36℃±1℃温箱内，培养18h~24h，然后取出，观察菌落形态，并做革兰氏染色实验。 大肠菌群最可能数（MPN ）的报告根据 大肠菌群阳性管数，检索MPN 表，报告每克（或毫升）样品中 大肠菌群的MPN 值。 革兰氏染色 一