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标记免疫分析;第一节 放射免疫分析 ; Ag + Ab → AgAb+Ag*↓Ag*Ab ; 当反应体系中同时存在Ag、Ag *和Ab，而Ag *的量一定、Ab的量限定（分子数少于抗原）时，随着Ag的增加，Ag * Ab的量相应减少，即与Ag（包括标准抗原或待测抗原）的量呈负相关竞争性抑制。当反应达到平衡后，将反应体系中的标记抗原抗体复合物与游离的标记抗原分离，测定其放射性。以标准抗原的浓度为横坐标，以标记抗原抗体复合物的结合率（B/T、B/F、B/B0）为纵坐标，绘制剂量效应曲线（calibration curve），也称标准曲线。;试剂盒组成：（以T4测定为例） 1、Ag (系列标准品)，浓度分别为： 0、20、40、80、160、320ng/ml 2、Ag*，125I-T4（红色，作为示踪剂） 3、Ab， 抗T4抗体（作为结合剂） 4、分离剂（免疫分离剂，结合反应达到平衡后将结合部分与游离部分分开）; 0 20 40 80 160 320 待1 待2;第7页/共69页;放射免疫分析的几种标准曲线图： ;抗原抗体的结合反应遵循质量作用定律，即： ; k1和k2分别代表结合速度常数和解离速度常数，[Ag]、[Ab]、[AgAb]分别代表游离抗原、游离抗体和抗原抗体复合物的浓度。假设Ab0和Ag0分别代表抗原、抗体的初始浓度，B和F分别代表反应平衡时结合和游离抗原的%，（以分数表示，B+F=1），可以推导出B的函数式，;二、基本试剂 （一）、抗体（antibody） (1)、抗体的制备：抗体是体外放射分析中应用最广的结合剂，是用纯化的免疫原免疫动物制备而得，免疫的成败在于免疫原和动物种类以及注射途径、佐剂的使用、注射剂量和时间等。 ; 分子量超过5000的蛋白多肽物质具有较好的免疫原性，容易刺激高活度的抗体形成。分子量小于5000的肽类物质免疫原性低，需要与载体蛋白结合方能引起明显的抗体形成。应该指出，动物对抗原的免疫反应个体差异很大，当一批动物用同样的免疫原和免疫程序进行免疫时，往往只有部分动物产生满意的反应。;（2）抗血清（antiserum）的质量鉴定： 评价结合剂的主要指标有滴度、特异性和亲和力。 ; 选择结合率为50%时所对应的稀释度，作为该结合剂的稀释度，该稀释度即为滴度。抗体滴度越高表明???体的质量越好。 ;2）特异性测定：抗血清的特异性是指抗体与待测物以外的结构类似物结合的程度（又称交叉反应率）。 交叉反应百分率 =[Y]50/[Z]50×100% 其中[Y]50为被测物结合率50%时的浓度值；[Z]50为结构类似物结合率50%时的浓度值。干扰轻者特异性高。 ;第16页/共69页;3）亲和力和亲和常数测定：亲和力表示特定的抗原、抗体之间的结合能力，常用亲和常数KA来表示。KA越大，表示抗原、抗体之间结合能力越强，B/F值大，方法的灵敏度高。 随着单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb）技术的发展，提高了现代体外分析技术的特异性和亲和力。 ;（二）、放射性标记物 放射性标记物是体外放射分析的测量依据，常用的标记核素有125I和3H。 对标记物的质量要求包括： （1）比活度（specific activity）：体外放射分析法的定量范围一般在10-9-10-12mol水平，标记物的用量应等于或小于被测物的最小量，以得到较好的灵敏度。高比活度的标记物是确保分析方法灵敏度的前提。 ;（2）放化纯度（radiochemical purity）：一般要求标记物的放化纯度在95%以上，若放射性杂质过多，标准曲线的斜率降低，将会影响测定的灵敏度。 （3）免疫活性（immune activity）：标记物在标记和储存等过程中会造成损伤，使标记抗原的免疫活性下降，与抗体发生反应的能力减弱，甚至丧失，因此抗原活性的检测十分重要。要求标记抗原与待测抗原具有相同的免疫活性。;（4）稳定性（stability）： 稳定性是指标记抗原在合理储存的条件下，保持其全部性能不变的程度。许多因素可影响其性能的稳定性，如标记方法、标记位置、置换水平、理化环境等都可使放射性核素从标记抗原的分子上脱落下来，或造成标记分子聚合或解离，使放化纯度明显下降。当标记方法合理，保存条件完善时，货架期可达1-3月。 ;（三）、标准品（calibration standard） 标准品是样品定量的基础，它的质和量的变化会直接影响样品的测定值。 对标准品的要求包括： （1）标准品