基因工程菌生长代谢的特点.pptxVIP

基因工程菌生长代谢的特点; 大肠杆菌的蛋白/菌体量的比值是基本恒定的，因而菌体的生长速度反映了蛋白质的合成速度。 培养条件的改变，都会改变菌体的能量代谢和小分子前体的供应，影响生物大分子的合成和菌体的生长。 ;一、菌体的生长与能量的关系; 分批培养中选择不同的碳源，连续培养中控制稀释速率等都能一定范围内控制菌体的生长，从而控制乙酸的产生，减少它的抑制作用。 加入蛋氨酸和酵母提取物都能减少乙酸的产生。 ; 大肠杆菌中克隆携氧能力的VHB蛋白的基因，以提高菌体的氧摄取能力，可提高菌体比生长速率和菌体密度。 采用磷酸乙酰化酶缺陷株作为宿主细胞，阻止乙酸产生，可提高产量。 ;二、菌体生长与前体供应的关系; 质粒存在对菌体代谢的影响：中等拷贝质粒（56拷贝）的工程菌中与前体合成有关的酶增加，这些酶的基因大多受终产物的反馈调节。 高拷贝质粒的工程菌（240拷贝）中，生长速率和菌体总蛋白合成均减少。这与工程菌大量前体被利用引起前体不足，从而产生“严紧反应”有关。 ; “严紧反应”是当氨酰tRNA不足时,核糖体在密码子上停留,并合成被称为魔点的ppGpp的结果。 ppGpp是一个重要的调控分子。; 它的浓度增加会导致在合成mRNA和rRNA时RNA聚合酶在模板上的移动产生停顿，RNA链延长速度减慢，使游离的RNA聚合酶浓度降低，严紧控制的启动子如rrnA等的转录减少。 也可能ppGpp是通过干扰RNA聚合酶与PL启动子专一识别反应。 ;第五节 基因工程菌的不稳定性; 结构不稳定 指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。 ;一、质粒不稳定产生的原因 1.常见分裂不稳定的两个因素 ⑴含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率，质粒丢失率与宿主菌、质粒特征和培养条件有关。 ⑵这两种菌比生长速率差异的大小。丢失质粒的菌体在非选择性培养基中一般具有生长优势，在培养中会逐渐取代质粒菌而成为优势菌。 ;批; 2.常见结构不稳定的因素： 质粒自发缺失与质粒中短的正向重复序列之间的同源重组有关，具有两个串联启动子的质粒更容易发生缺失；???无同源性的两个位点之间也会发生缺失，培养条件也会对质粒结构不稳定产生影响。;质粒稳定性的分析方法;二、提高质粒稳定性的方法; 2 选择合适的载体 与载体在宿主菌中的拷贝数有关。低拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌频率高，增加工程菌质粒拷贝数可提高稳定性；高拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌频率低，但对稳定性不利。对同一工程菌控制不同的比生长速率可改变质粒的拷贝数。 ;3 选择压力 在培养基中加选择性压力抗生素，可以抑制质粒丢失菌的生长。添加抗生素选择压力对质粒结构不稳定无能为力。大规模生产时不可取。;4 分阶段控制培养 第一阶段先使菌体生长至一定的密度，使质粒稳定地遗传，第二阶段诱导外源基因的表达，由于第一阶段外源基因未表达，减小了重组菌与质粒丢失菌的生长速率的差别，增加了质粒稳定性。 ;5 控制培养条件 通过调控环境参数如温度、pH、培养基组分和溶解氧浓度、限制性营养物质来控制比生长速率。 6 固定化 不同的宿主菌及其质粒在固定化系统中均表现出良好的稳定性。;第八节 重组工程菌的培养;菌种 一级种子摇瓶 二级种子罐培养 扩大培养 原料 发酵培养 灭菌 发酵生产 代谢产物分离 基配制 微生物工业发酵过程简图 ;一、基因工程菌的培养方式;1 分批培养 为了保持基因工程菌生长所需的良好微环境，延长其生长对数期，获得高密度菌体，通常把溶氧控制和补料措施结合起来，根据基因工程菌的生长规律来调节补料的流加速率。;DO-Stat方法：调节搅拌转速和通气速率来控制溶氧在20%，用固定或手动调节补料的流加速率。 Balanced- DO-Stat方法:通过控制溶氧，搅拌转速及糖的流加速率，使乙酸维持在底浓度。 控制菌体比生长速率方法：调节葡萄糖流加速率以控制溶氧在20%，调解搅拌转速。;2 补料分批培养 补料分批培养是将种子接入发酵反应器中进行培养,经过一段时间后间歇或连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的方法。 ;3 连续培养 将种子接入发酵反应器中，搅拌培养至菌体浓度达一定程度后，开动进料和出料