溶菌酶综合型实验报告(很全面很详细).docxVIP

第 第 1 页 共 35 页 溶菌酶试验综合型实验报告 目录 第 1 章 引言 2 生化技术重要理论 2 蛋白质提取分离技术 2 第 2 章 实验准备 20 2.1 引言 20 2.2 仪器及材料 20 2.3 方法 20 第 3 章 酶的提取 22 3.1 引言 22 第4 章 酶的纯化 244.1 第 4 章 酶的纯化 24 4.1 引 言 24 4.2 方 法 25 第 5 章 酶活力、蛋白浓度测定 26 5.1 引 言 26 5.2 仪器及试剂 27 5.3 方法： 27 5.4 实验结果 29 第 6 章 酶促动力学（ Km 测定、酶的抑制） 30 6.1 引 言 30 6.2 仪器及试剂 31 6.3 方 法 31 6.4 结 论 32 第 7 章 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳测酶相对分子量及纯度鉴定 33 7.1 引 言 33 7.2 方 法 34 7.3 . 结 果 35 7.4 结 论 35 第 1 章引言 第 第2页共 35 页 生化技术重要理论 蛋白质提取分离技术 以蛋白质和结构与功能为基础，从分子水平上认识生命现象，已经成为现代生物学 发展的主要方向，研究蛋白质，首先要得到高度纯化并具有生物活性的目的物质。蛋白 质的制备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识，但基本原理不外乎两方面。一是得 用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相 中，如盐析，有机溶剂提取，层析和结晶等；二是将混合物臵于单一物相中，通过物理 力场的作用使各组分分配于来同区域而达到分离目的，如电泳，超速离心，超滤等。在 所有这些方法的应用中必须注意保存生物大分子的完整性，防止酸、硷、高温，剧烈机 械作用而导致所提物质生物活性的丧失。蛋白质的制备一般分为以下四个阶段：选择材 料和预处理，细胞的破碎及细胞器的分离，提取和纯化，浓细、干燥和保存。 微生物、植物和动物都可做为制备蛋白质的原材料，所选用的材料主要依据实验目 的来确定。对于微生物，应注意它的生长期，在微生物的对数生长期，酶和核酸的含量 较高，可以获得高产量，以微生物为材料时有两种情况： （1）得用微生物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞外酶等；（2）利用菌体含有的生化物质，如蛋白质、核酸和胞内 酶等。植物材料必须经过去壳，脱脂并注意植物品种和生长发育状况不同，其中所含生 物大分子的量变化很大，另外与季节性关系密切。对动物组织，必须选择有效成份含量 丰富的脏器组织为原材料，先进行绞碎、脱脂等处理。另外，对预处理好的材料，若不 立即进行实验， 应冷冻保存，对于易分解的生物大分子应选用新鲜材料制备。 蛋白质的分离纯化 蛋白质（包括酶）的提取 大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于 乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。 水溶液提取法 稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂， 通常 第 第 PAGE 3页共 35 页 用量是原材料体积的 1-5 倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋白质的溶解。提取 的温度要视有效成份性质而定。一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大， 因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。但另一方面，温度升高会使蛋白质变性失活， 因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温（ 5 度以下）操作。为了避免蛋 白质提以过程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制剂（如二异丙基氟磷酸，碘乙酸等） 。下面着重讨论提取液的 pH 值和盐浓度的选择。 ⑴ pH 值 蛋白质，酶是具有等电点的两性电解质，提取液的 pH 值应选择在偏离等电点两侧的 pH 范围内。用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生 变化，从而导致蛋白质构象的不可逆变化，一般来说，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提 取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。 ⑵盐浓度 稀浓度可促进蛋白质的溶，称为盐溶作用。同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结 合， 具有保护蛋白质不易变性的优点，因此在提取液中加入少量 NaCI 等中性盐，一般以 0.15 摩尔。升浓度为宜。缓冲液常采用 0.02-0.05M 磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。 有机溶剂提取法 一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐 溶液、稀酸或稀碱中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂，它们具的一定的亲水性，还 有较强的亲脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必须在低温下操作。丁醇提取法对提 取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越，一是因为丁醇亲脂性强，特别是溶解磷 脂的能力强；二是丁醇兼具亲水性，在溶解度范围内不会引起酶的变性失活。另外，丁 醇提取法的 pH