双脱氧末端终止测序法原理过程和目标基因cDNA序列拼接.pptxVIP

双脱氧末端终止法测序的原理、过程和目标基因序列的分析;1. Sanger双脱氧链终止法测序原理;基本原理：;6;2、具体操作：;同理第二个反应产生的都是以C结尾的; 第三个反应的都以G结尾, 第四个反应的都以T结尾, 电泳后就可以读出序列了.;假如有一个DNA, 互补序列是GATCCGAT, 我们试着做一下: 在第一个反应中由于含有dNTP + ddATP, 所以遇到G, T, C三个 碱基时没什么问题, 但遇到A时, 掺入的可能是dATP或ddATP, 比如已合成到G, 下一个如果参与反应的是ddATP则终止, 产生一个仅有2个核苷酸的序列: GA, 否则继续延伸, 可以产生序列GATCCG, 又到 了下一个A了. 同样有两种情况, 如果是ddATP掺入, 则产生的序列是 GATCCGA, 延伸终止, 否则可以继续延伸, 产生GATCCGAT.;制得的四组混合物全部平行地点加在变性聚丙烯酸受凝胶电泳板上进行电泳，每组制品中的各个组分将按其链长的不同得到分离，从而制得相应的放射性自显影图谱。从所得图谱即可直接读得DNA的碱基序列。;制备单链模板 ↓ 将单链模板与一小段引物退火 ↓ 加入DNA多聚酶4种脱氧核苷酸 分别加入少量4种双脱氧核苷酸 ↓ 将4种反应产物分别在4条泳道电泳 ↓ 根据4个碱基在4条泳道的终止位置读出基因序列;4、 高通量自动化测序;高速自动DNA测序仪的结构及工作原理;荧光化合物标记链 终止法以荧光颜色为标 记信号，每种ddNTP各 有1种代表颜色；整个 反应在一个试管中进行；当新合成的终止单链通 过荧光监测仪时，可由 光信号读出末端核苷酸 并由电脑记录。;16;Sanger双脱氧链终止DNA测序法的测序能力：;二、序列比对分析;同源性(homology)： 指从一些数据中推断出的两个基因或蛋白质序列具而共同祖先的结论，属于质的判断。就是说A和B的关系上，只有是同源序列，或者非同源序列两种关系。而说A和B的同源性为80％都是不科学的。;序列的相似性和序列的同源性有一定的关系，一般来说 序列间的相似性越高的话，它们是同源序列的可能性就更高，所以经常可以通过序列的相似性来推测序列是否同源。;序列相似性比较：;序列同源性分析：;2. Blast简介及应用;Blast 是一个序列相似性搜索的程序包，其中包含了很多个独立的程序，这些程序是根据查???的对象和数据库的不同来定义的。比如说查询的序列为核酸，查询数据库亦为核酸序列数据库，那么就应该选择blastn程序。;主要的blast程序;（2） Blast资源;Blast结果会列出跟查询序列相似性比较高，符合限定要求的序列结果，根据这些结果可以获取以下一些信息：;（3）Blast应用;Blast任务提交表单1;Blast任务提交表单2;Blast任务提交表单3;提交任务;结果页面1;结果页面2;结果页面3;（4）一个例子;具体步骤：;1.登陆ncbi的blast主页;3.填入序列（copy＋paste） Fasta格式，或者纯序列;6.限制条件，我们限制在病毒里面找。;8.输出格式选项保持默认值;10.查询序列的一些相关信息;图形结果;匹配序列列表;具体匹配情况;思 考 题;内容总结