基因表达及功能分析基本策略.pptxVIP

基因表达及功能分析基本策略;一、通过检测mRNA 揭示基因转录水平的表达特征;（一）基于杂交原理的方法可检测mRNA表达水平;Northern印迹分析原理示意图;2．核糖核酸酶保护实验 （ribonuclease protection assay，RPA） 可用于mRNA定量和RNA剪接分析 是一种基于杂交原理分析mRNA的方法，既可对mRNA进行定量分析又可研究其结构特征，灵敏度和特异性都很高。 ;核糖核酸酶保护实验原理示意图;可对mRNA进行区域定位 是利用杂交原理建立的组织原位mRNA检测技术，可对细胞或组织中原位表达的mRNA进行区域定位。同时也可作为定量分析的补充。 通过设计与目标mRNA碱基序列互补的寡核苷酸序列，标记后作为探针；该探针能够特异性地与目标靶序列杂交，检测标记信号来确定基因在组织和细胞内表达的区位信息。 虽然原位杂交在功能性方面提供的信息较少，但是该技术还是被广泛用于组织中的基因表达分析，这是因为其较高的稳定性、较广泛的靶点和组织适用性。;（二）两种变换的聚合酶链式反应是常用的mRNA检测方法; 常用于mRNA的定量分析 实时定量PCR (Real-time Quantitative Polymerase chain Reaction,RQ-PCR)是定量分析mRNA的最通用、最快速、最简便的方法，该方法是对PCR反应进行实时监测，具有很高的灵敏度和特异性。 ;目前有5种技术用于实时定量PCR： 其中最经济、简便的技术是利用荧光染料（如SYBR Green ）与双链DNA分子结合发光的特性，指示扩增产物的增加； 其他4种方法都是以荧光染料标记的寡核苷酸为探针与正确的扩增子杂交，包括5’核酸酶法（即人们熟知的TaqManTM）、分子信标、ScropionsTM和探针杂交法，它们拥有更强的特异性，可以避免对PCR后溶解曲线的需求，以及后续的Southern杂交或对扩增子的测序鉴定，但是成本较高。;SYBR Green实时定量PCR分析原理示意图 ;二、通过蛋白质检测揭示基因 翻译水平的表达特征; 蛋白质样品的制备 SDS分离 蛋白质转膜 特异抗体（即第一抗体）与膜上的蛋白质（抗原）印迹杂交 再经偶联了可检测标记信号的第二抗体（即抗抗体，商品试剂盒中多采用偶联辣根过氧化物酶的Ig） 最后经与酶的底物反应而显影、成像，经扫描后获取???疫印迹信息; 酶联免疫吸附分析（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）也是一种建立在抗原-抗体反应基础上的蛋白质分析基本方法。 该方法不需经电泳分离待检样品蛋白质，而是预先将样品包被在支持体上，以后反应过程与Western印迹大致相同——顺序结合（即“吸附”）特异抗体（一抗）及与酶连接的第二抗体（也可预先包被抗体，“吸附”抗原），再进行酶-底物反应。反应后通过专门的酶标仪测定、记录数据。 ;特点： 具有特异性； 灵敏度很高； 稳定、操作简便，标本用量少，适于大规模筛查，尤其适用于检测体液中微量的特异性抗体或抗原； 既可以做定性试验也可以做定量分析。 被广泛应用于微生物学、寄生虫学、肿瘤学和免疫学等领域。; 免疫组织化学（immunohistochemistry）与免疫细胞化学（immunocytochemistry）原理相同，都是利用标记的特异性抗体通过抗原-抗体反应和显色反应，在组织或细胞原位检测特定抗原（即目标蛋白质）的方法，简称为免疫组化实验。近年来由于荧光标记抗体的广泛应用，这两种方法又被统称为免疫荧光法。 ;（immunofluorescence），可应用荧光（倒置）显微镜或激光共聚焦显微镜（confocal microscopy）对靶分子进行定性、定量和定位分析，激光共聚焦显微镜还可进行断层成像，是在蛋白质水平分析基因表达的直观方法。 其中抗体对于蛋白质靶点的特异性、种间交叉反应、检测系统的灵敏性以及细胞或组织的固定类型是该方法的关键因素。 运用双重着色或多重着色程序同时对多个感兴趣的靶分子进行检测，是一种揭示更多有关细胞群的功能和它们之间相互作用信息的有效方法。 免疫组化主要是作为定性、定位的技术，若结合密度计量系统、图像分析系统等测量工具也可以得到定量的数据。 ; 流式细胞术（flow cytometry）在细胞水平分析特定蛋白质的基本原理也是抗原-抗体反应，它利用荧光标记抗体与抗原的特异性结合，经过流式细胞仪分析荧光信号，从而根据细胞表达特定蛋白质的水平对某种蛋白质阳性细胞（即特异基因表达的细胞）作出判断。 ;流式细胞术可以检测活细胞，也可以检测用甲醛固定的细胞。 广泛应用于细胞表面和细胞