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苯酚-硫酸比色法测定白多糖的研究 白蜡树是兰科植物的干燥茎，也被称为小白牙、莲草和雪末。 白芨多糖具有收敛止血、消肿生肌等功能 实验以葡萄糖为标准品, 采用苯酚-硫酸比色法 (硫酸将白芨多糖催化水解成单糖, 单糖迅速脱水生成糠醛及其衍生物再与苯酚或蒽酮作用生成有色物质 1 材料和方法 1.1 材料表面 1.1.1 兰科白(白) 白芨:购买于瑞丽市台丽街综合批发市场 (经鉴定为兰科白芨属白芨) 。将白芨块茎洗净, 沥干, 切片, 放入烘箱60℃烘干、粉碎后, 过40目筛, 收集, 放入干燥器中密封保存, 备用。 1.1.2 试剂 葡萄糖标准品, 优级纯, 国药集团化学试剂有限公司;苯酚, 分析纯, 天津市化学试剂三厂;浓硫酸, 分析纯, 重庆东川化工。 1.1.3 紫外-可见分光光度仪、电子天平、药材粉碎机 T6型紫外-可见分光光度仪 (北京普析通用仪器有限公司) ;UV-8000ST紫外-可见分光光度仪 (上海元析仪器有限公司) ;电子天平 (梅特勒-托利多仪器 (上海) 有限公司) ;中药材粉碎机 (台湾弘荃机械企业有限公司) ;电热鼓风干燥箱 (上海博讯实业有限公司医疗设备厂) 。 1.2 方法 1.2.1 滤渣的提取 称取白芨粗粉2.0 kg, 用75%乙醇提取2次, 每次2 h, 过滤, 滤渣干燥。称取干燥后的滤渣1.0 kg, 加入15倍量的水提取2 h, 离心过滤后, 滤渣再用10倍量的水提取2 h, 合并滤液。将滤液浓缩至相对密度为1.15, 加入95%乙醇, 边加边搅拌, 直至大量沉淀产生, 静置过夜, 滤出沉淀, 干燥、粉碎即得白芨粗多糖。 1.2.2 白粗多糖待测样品溶液的制备 葡萄糖标准溶液配制精密称取已恒重的葡萄糖标准品0.100 1 g, 溶解后, 转移至100 mL容量瓶中, 定容至刻度, 充分摇匀, 静置30 min。吸取2.0 mL于50 mL容量瓶中, 定容, 摇匀后, 即得40.04 ug/mL的葡萄糖标准溶液。 待测样品溶液配制精密称取已恒重的白芨粗多糖0.100 0 g, 溶解后, 转移至100 mL容量瓶中, 定容至刻度, 充分摇匀静置30 min。吸取2.0 mL于50 mL容量瓶中, 定容, 摇匀后, 即得白芨粗多糖待测样品溶液。 6%苯酚溶液的配制精密称取苯酚6.00 g, 溶解后, 转移至100 mL棕色容量瓶中, 定容, 充分摇匀, 静置, 避光保存。 1.2.3 浓硫酸溶液的加入 分别吸取葡萄糖标准溶液0.0、1.0 mL于2支具塞比色管中, 使总体积均为1.0 mL, 加入6%苯酚溶液1.2 mL, 摇匀后, 沿管壁缓慢加入浓硫酸6.5 mL, 摇匀, 静置, 冷却。以葡萄糖标准溶液0.0 mL为空白对照, 选择400～600 nm波长范围, 按10.0 nm的精度进行多波长扫描, 以吸收波长λ为横坐标, 吸光度A为纵坐标, 绘制吸光度-吸收波长关系曲线, 确定最大吸收波长。 1.2.4 浓硫酸加入量 分别吸取葡萄糖标准溶液各1.0 mL, 置于9支具塞比色管中, 依次加入6%苯酚溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL, 加水使各管体积均为3.2 mL, 摇匀, 各管分别沿管壁缓慢加入浓硫酸6.5 mL, 摇匀, 静置30 min。冷水冷却, 于490 nm处测定吸光度。以苯酚用量为横坐标, 吸光度A为纵坐标, 绘制吸光度-苯酚用量关系曲线, 确定苯酚溶液用量。 1.2.5 浓硫酸加入量 分别吸取葡萄糖标准溶液各1.0 mL, 置于9支具塞比色管中, 依次加入6%苯酚溶液1.2 mL, 摇匀后沿管壁缓慢加入浓硫酸3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0 mL, 加水使各管体积均为9.2 mL, 摇匀静置60 min。冷水冷却后, 于490 nm处测定吸光度。以浓硫酸用量为横坐标, 吸光度A为纵坐标, 绘制吸光度-浓硫酸用量曲线, 确定浓硫酸用量。 1.2.6 浓硫酸温度的确定 分别吸取葡萄糖标准溶液1.00 mL, 置于9支具塞比色管中, 加入6%苯酚溶液1.2 mL, 摇匀后沿管壁缓慢加入浓硫酸6.5 mL, 摇匀, 分别静置10、20、30、40、50、60、70、80、90 min。冷水冷却后, 于490 nm处测定吸光度。以反应时间t为横坐标, 吸光度A为纵坐标, 绘制吸光度-反应时间曲线, 确定反应的适宜时间及稳定性。 1.2.7 葡萄糖吸光度的测定 分别吸取葡萄糖标准溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL置于具塞比色管中, 加水使体积均为1.0 mL, 加入6%苯酚溶液1.2 mL, 摇匀后沿管壁缓慢加入浓硫酸6.5 m L, 摇匀静置60 min。冷水冷却后, 以葡萄