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6种真菌多糖含量测定方法的比较 比色法是一种传统的糖含量测定方法。基本原理是用硫酸或盐酸处理糖，将糖从ph值中脱水，生成抗胆红素或衍生物，然后测量反应溶液的吸收值，并将标准曲线结合起来测定糖。 在以上比色法中, 最常用的是苯酚-硫酸法, 其稳定性、精确性要明显优于其它两种。于村等人比较了蒽酮-硫酸法、苯酚-硫酸法、直接滴定法对香菇多糖含量的测定 在对反应液的吸光值测定时, 最常用的是紫外可见分光光度计法, 该方法精密度高、重复性好、操作相对简单 肖建辉 1 材料和机器 1.1 材料表面 1.2 试剂 葡萄糖、苯酚、浓硫酸 (分析性纯, 天津市永大化学试剂有限公司) 1.3 仪器和设备 KQ5200型数控超声波清洗器, 昆山市超声仪器有限公司;QT-1漩涡振荡器, 郑州南北仪器设备有限公司;TDL-5-A离心机上海安亭科学仪器厂;Multiskan FC酶标仪, 热电公司。 2 测量 2.1 测定细菌中的糖含量 2.1.1 糖提取 多糖的提取参照农业行业标准NY/T1676~2008进行 2.1.2 苯酚溶液的制备 0.1 mg/mL葡萄糖标准溶液的配制:称取0.1000 g烘至恒重的葡萄糖, 加水溶解, 定容至1000 mL, 置于4℃冰箱中贮存。 显色反应:分别吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL标准葡萄糖液置于20 mL具塞试管中, 用去离子水补充至1.0 mL。向试液中加入5%的苯酚溶液, 然后迅速加入5.0 mL浓硫酸 (与液面垂直加入, 勿接触试管壁) , 静止10 min, 使用漩涡振荡器充分混合, 将试管置于30℃水浴锅中反应20 min, 使用酶标仪490nm下测定吸光度。以葡萄糖质量浓度为横坐标, 吸光度为纵坐标, 制定标准曲线。 2.1.3 样品测定 吸取提取液1.0 mL于20 mL具塞试管中, 按照上述方法进行显色反应, 于490 nm下测定吸光度, 结合标准曲线计算多糖含量。 2.1.4 计算公共格式 W—样品中多糖的百分含量, 单位, %;m 2.2 方法评估 2.2.1 葡萄糖含量的测定 葡萄糖标准储备液:将0.1 mg/mL葡萄糖标准液依次稀释成0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg/mL的储备液 实验方法:分别取某样品提取液和6个梯度的葡萄糖储备液1 mL进行显色反应, 在0~120 min内, 490 nm下测定吸光值, 计算葡萄糖含量。 2.2.2 葡萄糖含量测定 实验方法:分别取某样品提取液、0.04 mg/mL葡萄糖储备液各6份, 每份1 mL进行显色反应, 490 nm下测定吸光度, 计算葡萄糖含量。 2.2.3 加标回收率的测定 实验方法:共7组实验, 每组加0.5 mL的某样品提取液, 然后分别加0.5 mL的去离子水、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg/mL葡萄糖贮备液, 进行反应, 490 nm下测定吸光度, 计算回收率。 3 结果 3.1 样品的选择和快速采集 从实验结果来看, 线性方程的R 实际测定时, 包括平行在内, 待测液有十几个, 用分光光度计时需要不断的更换、清洗比色皿, 同时由于使用苯酚和浓硫酸硫酸, 又容易损伤皮肤, 而选用酶标仪时, 使用移液枪精确吸取即可, 实验的危险性降低, 同时样品可快速测出。 3.2 试验方法的评估结果 3.2.1 系统误差的测定 根据测定的各溶液显色反应后的吸光值, 计算各溶液中的葡萄糖含量, 然后计算各组的SD值及RSD值, 结果见表1。 实验结果表明, 在2 h内, 只有0.01 mg/mL的储备液这组的RSD值稍高, 为3.918%, 实验过程中这几个浓度都是在同一条件下进行的, 该组较大的误差应该属于系统误差。其各组的RSD值均小于5%, 说明酶标仪测定出各溶液的吸光度是稳定的, 该方法的稳定性比较高。 3.2.2 葡萄糖含量的测定 根据测定的吸光值, 计算提取液显色后、葡萄糖储备液中的葡萄糖含量, 结果见表2。 从实验结果来看, 6组重复下的实验结果很接近, 且RSD值均小于5%, 说明该方法具有良好的重复性。 3.2.3 加标回收率实验 根据测定的7组吸光值, 计算各组的糖含量, 进一步计算各做的回收率, 结果见表3。 7组加标回收率实验的平均值为99.29%, RSD为2.105%, 说明这种方法有较高的回收率, 准确度较高。 通过以上稳定性、重复性、加标回收率实验的结果可以看出, 酶标仪法具有较高的稳定性、重复性和回收率, 这种方法应用于测定多糖含量, 有较高的准确性。 3.3 样品测定结果 4 方法的精密性实验和使用酶标仪的方法 通过以上实验可以看出, 酶标仪和紫外可见分光光度计一样都可用于多糖含量测定, 而酶标仪与分光光度计相比, 有更多的优