蛋白质沉淀(Protein Precipitation)浓缩方法原理及详细解析-2.pdfVIP

蛋白质沉淀(Protein Precipitation)浓缩方法原理及详细解析-2 二．硫酸铵的使用 硫酸铵中常含有少量的重金属离子，对蛋白质巯基有敏感作用，使用 前必须用H2S处理：将硫酸铵配成浓溶液，通入H2S 饱和，放置过夜， 用滤纸除去重金属离子，浓缩结晶，100℃烘干后使用。另外，高浓度 的硫酸铵溶液一般呈酸性（PH=5.0左右），使用前也需要用氨水或硫 酸调节至所需PH。 硫酸铵的加入有以下几种方法：1）加入固体盐法用于要求饱和度较高 而不增大溶液体积的情况；2）加入饱和溶液法用于要求饱和度不高而 原来溶液体积不大的情况；3）透析平衡法先将盐析的样品装于透析袋 中，然后浸入饱和硫酸铵中进行透析，透析袋内硫酸铵饱和度逐渐提 高，达到设定浓度后，目的蛋白析出，停止透析。该法优点在于硫酸 铵浓度变化有连续性，盐析效果好，但手续烦琐，需不断测量饱和度， 故多用于结晶，其它情况少见。 使用固体硫酸铵时：1）必须注意饱和度表中规定的温度，一般有0℃ 或室温两种，加入固体盐后体积的变化已考虑在表中； 2）分段盐析中， 应考虑每次分段后蛋白质浓度的变化。一种蛋白质如经二次透析，一 般来说，第一次盐析分离范围（饱和度范围）比较宽，第二次分离范 围较窄。3）盐析后一般放置半小时至一小时，待沉淀完全后才过滤或 离心。过滤多用于高浓度硫酸铵溶液，因为此种情况下，硫酸铵密度 较大，若用离心法需要较高离心速度和长时间的离心操作，耗时耗能。 离心多用于低浓度硫酸铵溶液。 第二节有机溶剂沉淀法 有机溶剂的沉淀机理是降低水的介电常数，导致具有表面水层的生物 大分子脱水，相互聚集，最后析出。该法优点在于：1）分辨能力比盐 析法高，即蛋白质或其它溶剂只在一个比较窄的有机溶剂浓度下沉淀； 2）沉淀不用脱盐，过滤较为容易；3）在生化制备中应用比盐析法广 泛。其缺点是对具有生物活性的大分子容易引起变性失活，操作要求 在低温下进行。总体来说，蛋白质和酶的有机溶剂沉淀法不如盐析法 普遍。 有机溶剂的选择首先是能和水混溶，使用较多的有机溶剂是乙醇、甲 醇、丙酮，还有二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙腈和2-甲基-2,4戊二 醇等。 有多种因素影响有机溶剂的沉淀效果：1）温度低温可保持生物大分子 活性，同时降低其溶解度，提高提取效率；2）样品浓度和PH 与盐析 法中的作用基本相同；3）金属离子一些多价阳离子如Zn2++和Ca2+在 一定PH下能与呈阴离子状态的蛋白质形成复合物，这种复合物在水中 或有机溶剂中的溶解度都大大下降，而且不影响蛋白质的生物活性。 4） 离子强度盐浓度太大或太低都对分离有不利影响，对蛋白质和多糖而 言盐浓度不超过5%比较合适，使用的乙醇量不超过二倍体积为宜。 第三节其他沉淀法 一．等电点沉淀法 两性电解质分子上的净电荷为零时溶解度最低，不同的两性电解质具 有不同的等电点，以此为基础可进行分离。如工业上生产胰岛素时， 在粗提液中先调 pH8.0去除碱性蛋白质，再调pH3.0去除酸性蛋白质。 利用等电点除杂蛋白时必须了解制备物对酸碱的稳定性，不然盲目使 用十分危险。不少蛋白质与金属离子结合后，等电点会发生偏移，故 溶液中含有金属离子时，必须注意调整PH值。等电点法常与盐析法、 有机溶剂沉淀法或其他沉淀方法联合使用，以提高其沉淀能力。