生物显微技术：有关于免疫细胞化学和免疫组织化学.ppt

第一节 免疫组织化学概述;一、免疫组化技术的基本原理和分类 免疫组化利用抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫小鼠等实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）。 ;通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。 组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。;分类;二、免疫组织化学的发展;三、免疫组化技术的优点;四、免疫组化技术的应用;1、确定细胞类型 2、辨认细胞产物 3、了解分化程度 4、鉴定病变性质 5、发现微小转移灶 6、探讨肿瘤起源或分化表型 7、确定肿瘤分期 8、指导治疗和预后 9、辅助疾病诊断和分类 10、寻找感染病因;五、免疫组织化学技术基本过程;（1）抗体选用：一般来讲，多克隆抗体的抗原专一性较差，非特异性反应较明显，效价不太稳定；但多克隆抗体制备简便，价格低廉，抗体效价较高，稀释度一般在1∶100~1000之间，适应性强，有部分多抗表达抗原特异性较好。单克隆抗体的抗原专一性强，质量和效价稳定，非特异性反应较少，标记结果可靠，但单克隆抗体制备复杂，价格昂贵，抗体效价较低，稀释度在1∶50~100。因此，应根据实际需要选择合适的抗体。 （2）抗体分装：购入的抗体（除非只够数次用量）一般需要分装在多个安瓿中，根据月需要量，大致每安瓿含5~20微升。除留下一支现用，其余应立即放置低温冰箱内贮存（-20 ℃以下）。用一支取一支，以免长期保存在4 ℃冰箱内失效。;（二）组织处理 1、组织及时取材和固定? 组织标本及时的取材和固定是做好免疫组化染色的关键第一步，可有效防止组织自溶坏死，抗原丢失，离体组织应尽快的进行取材，最好2h内。组织块大小要适中，一般在2.5cm×2.5cm×0.2cm。 对于固定液的选择，原则上讲，应根据抗原的耐受性来选择相应的固定液，但很难做到这一点，10%的中性缓冲福尔马林或4%缓冲多聚甲醛4倍于组织体积进行组织固定，但组织固定时间最好在l2h内，一般固定时间不应超过24h。 ;2、组织脱水、透明、浸蜡? 组织经固定后进行脱水、透明、浸蜡和包埋。掌握的原则是脱水透明要充分但不能过，浸蜡时间要够，温度不能高，否则造成组织的硬脆使组织切片困难，即使能切片，由于组织的硬脆，也使切片不能完好平整，染色过程中极易脱片，对免疫组化染色抗原的定位及背景都不利，所以无水酒精脱水和二甲苯透明的时间不宜过长，正常大小的组织无水酒精脱水1h×3次，二甲苯透明1h×2次即可，浸蜡及包埋石蜡温度不要超过65℃。 ; ;1、Poly-L-Lysine (多聚左旋赖氨酸)??? 2、明胶硫酸铬钾法? 将2.5g明胶加热溶于500ml蒸馏水中，完全溶解冷却后加入0.25g硫酸铬钾搅匀充分溶解即可使用。方法是将玻片浸泡其中2min，取出控尽液体入温箱中烤干备用。此法价格便宜、方法简单，任何实验都可以使用，特别适用于大批量的使用，但应注意，如果液体变蓝或粘稠状停用。 3、APES (3-氨丙基-乙氧基甲硅烷)??? 切片必须保持切片刀锐利，切片要薄而平整、无皱摺、无刀痕，如有上述问题的切片在进行免疫组化染色都将出现假阳性现象，切片厚度一般为3~4μm，切好的切片在60℃温箱中过夜，注意烤片的温度不宜过高，否则易使组织细胞结构破坏，而产生抗原标记定位弥漫现象。;（四）抗原修复? 经甲醛固定的部分组织细胞，可使免疫组化标记敏感性明显降低，这是因为甲醛固定过程中形成醛键或保存的甲醛会形成羧甲基而封闭部分抗原决定簇。因此，在染色时，有些抗原需先进行修复或暴露。 因此抗原修复主要用于福尔马林或多聚甲醛固定的石蜡包埋组织切片。 ;1、抗原热修复 是以高温、高压对常规固定的石蜡切片进行抗原修复或复原的一种非蛋白酶消化以提高抗原抗体阳性检测的一种方法和技术手段。 （1）高压热修复 在沸水中加入EDTA（pH8.0）或0.01 M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）。盖上不锈钢高压锅的盖子，但不进行锁定。将玻片置于金属染色架上，缓慢加压，使玻片在缓冲液中浸泡5分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10分钟后，去除热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。;（2