不同地区麦冬遗传多样性的ISSR分析.docxVIP

? ? 不同地区麦冬遗传多样性的ISSR分析 ? ? 胡仲义，吴　帆，徐兵兵，张　晶，戴智慧，倪　穗* (1.宁波城市职业技术学院，浙江 宁波 315502；2.宁波大学 应用海洋生物技术教育部重点实验室，浙江 宁波 315211) 不同地区麦冬遗传多样性的ISSR分析 胡仲义1，吴帆2，徐兵兵2，张晶2，戴智慧2，倪穗2* (1.宁波城市职业技术学院，浙江 宁波 315502；2.宁波大学 应用海洋生物技术教育部重点实验室，浙江 宁波 315211) 利用ISSR分子标记技术对5个地区6个麦冬居群进行遗传多样性分析。选用10条扩增带型清晰且重复性好的引物进行扩增，共获得115条带，其中89条具有多态性，多态性比例为77.39%。当遗传相似系数(GS)为0.61时，可将6个麦冬居群分为2大类群。居群的GS平均值为0.643，表明供试居群之间存在较近的亲缘关系，且地域越近的其亲缘关系关系越近。研究表明ISSR分子标记技术能够很好地用于不同地域同种物种的亲缘关系分析。 麦冬； ISSR-PCR； 亲缘关系； 遗传多样性 麦冬(Ophiopogonjaponicus)为百合科沿阶草属多年生草本植物。中医学上以麦冬地下块根入药。临床证明，麦冬块根对肺燥干咳、虚劳咳嗽、津伤口渴、心烦失眠、肠燥便秘等症具有很好的疗效[1]。根据麦冬产地不同，可将麦冬分为四川麦冬、湖北麦冬、浙麦冬等品系。近年来，对这三种麦冬的研究大多数都着眼于其内部的化学成分、药理毒理、数量遗传性状等方面[2-4]，对三者种质资源鉴定和其遗传多样性的研究较少。 ISSR(inter-simple sequence repeats，简单序列重复区间扩增多态性)技术是1994年发展起来的一项基于微卫星技术的新型的分子标记技术。相对于RAPD和SSR分子标记而言，ISSR引物具有更高的退火温度，从而保证了更高的稳定性和重复性。此外，由于ISSR所使用的引物为非特异性引物，故不需要预先知晓序列信息，既可以节约人力物力成本。由于ISSR的简便快捷，近年来其已经应用于植物亲缘关系、指纹图谱及种质资源遗传多样性等领域的研究。本实验以四川麦冬、浙麦冬和湖北麦冬为研究对象，利用ISSR分子标记方法研究三种麦冬品系的遗传多样性。以期为各地麦冬的种植、资源保护和优良品种选育提供理论依据。 1　材料与方法 1.1实验材料 实验材料来源于湖北武汉、湖北襄阳、浙江慈溪、四川成都、贵州遵义等地，采其新鲜幼嫩叶片并对不同居群标号(表1)，用无菌水洗净后晾干，装入灭菌离心管内，封口胶封口，保存于-80 ℃超低温冰箱中。 表1　实验材料产地及类型 1.2主要试剂与仪器 试剂：十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、Tris-HCl、乙二胺四乙酸(EDTA)、氯化钠、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，氯仿、异戊醇等均为分析纯；2×Easy Taq PCR Supermix (+dye)；ISSR引物(华大基因合成)；超纯水。 仪器：冷冻离心机(Sigma)、电泳仪(北京六一仪器厂)、超净工作台、水浴锅、PCR仪、UVP凝胶成像系统。 1.3实验方法及步骤 1.3.1麦冬总DNA提取 由于麦冬叶片中含有大量的多糖、酚等物质，若采用传统CTAB法进行实验则会因为杂质太多而降低DNA的纯度。故参考王冠明[5]等的方法，经过多次实验摸索出适合麦冬的改进CTAB法。 具体操作步骤如下：取新鲜幼嫩的麦冬叶片于预冷的研钵中，加入少量PVP粉末和石英砂，加入液氮迅速研磨至样品彻底成为粉末，后迅速转移至2 mL预冷离心管中，加入1.5 mL预冷的核分离液 (250 mmol/L NaCl，200 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)，50 mmol/L EDTA (pH 8.0)，2% PVP (w/v)，1%巯基乙醇(v/v))，混合均匀后冰上静置20 min。4 ℃下3000 r/min离心5 min，弃上清液和胶状粘稠物质及壁上残留。若上清液颜色较深则重复抽提一次。在沉淀中加入700 μL 65 ℃预热的CTAB缓冲液、14 μL β-巯基乙醇，65 ℃水浴40 min。期间轻摇离心管数次，后4 ℃10 000 r/min离心10 min。将上清液转移至新的2 mL预冷灭菌离心管内，加入等体积的氯仿-异戊醇，轻轻上下颠倒2 min，静置5 min后4 ℃10 000 r/min离心10 min。后重复此步骤一次。取上清液于新的2 mL预冷灭菌离心管内，加入2.5倍体积的-20 ℃预冷的无水乙醇。上下轻轻颠倒至完全混合均匀后-20 ℃冷冻过夜。后4 ℃10 000 r/min离心10 min，1 mL -20 ℃预冷的无水乙醇洗涤沉淀一次，再4 ℃ 10 000 r/min离心10 min。加入200 μL灭菌超纯水