DB32T 3762.14—2021新型冠状病毒检测技术规范 第14部分N亚基因组荧光PCR检测程序.docxVIP

ICS FORMTEXT 11.020 FORMTEXT C 62 FORMTEXT ????? DB FORMTEXT 32 FORMTEXT 江苏省地方标准 DB 32/T 3762.14—2021 FORMTEXT ????? FORMTEXT 新型冠状病毒检测技术规范 第14部分：N亚基因组荧光PCR检测程序 FORMTEXT Technical specifications for SARS-CoV-2 detection Part 14: Real-time fluorescence PCR test N subgenomic RNA procedure FORMTEXT ????? FORMTEXT 2021 -12-09发布 2022 -01-09实施 FORMTEXT 江苏省市场监督管理局???发布 DB32/T 3762.14—2021 PAGE 3 新型冠状病毒检测技术规范 第14部分：N亚基因组荧光PCR检测程序 范围 本文件规定了新型冠状病毒N亚基因组荧光PCR检测环境与设施、设备与耗材、试剂与材料、样本前处理与核酸提取、扩增体系配制与扩增、结果判定。 本文件适用于新型冠状病毒N亚基因组荧光PCR检测，为判断样本中的新型冠状病毒是否具有感染性提供辅助手段。 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改版）适用于本文件。 DB32/T 3762.3 新型冠状病毒检测技术规范 第3部分：核酸荧光PCR检测程序 术语和定义 亚基因组 RNA subgenomic RNA，SgRNA 在结构上由病毒5’UTR区Leader序列及各基因转录RNA片段构成，亚基因组的出现可反应病毒复制状态，从而代表病毒的感染性。 环境与设施 同 DB32/T 3762.3 的4.1条和4.2条。 设备与耗材 同 DB32/T 3762.3 的5.1条和5.2条。 试剂与材料 试剂 病毒核酸提取试剂盒。 实时荧光PCR检测试剂。 引物与探针 新型冠状病毒N亚基因组的荧光定量 PCR 引物、探针组合物（序列见附录A），其中探针的5’端标记的是FAM荧光报告基团，3’端标记的是BHQ1荧光淬灭基团。阴性对照为DEPC水、阳性对照为含N亚基因组片段的质粒（序列见附录A）。 材料 同 DB32/T 3762.3 的6.2条。 样本前处理与核酸提取 同 DB32/T 3762.3-2020 的7.1条和7.2条。 扩增体系配制与扩增 采用实时荧光PCR检测试剂，根据试剂说明书配制荧光PCR扩增体系，N亚基因组反应体系中上/下游引物（20 μmol/L）0.4 μL/ 0.4 μL，探针（10 μmol/L）0.4 μL每个反应体系中加入模板RNA 4 μL (或阳性、阴性对照)、无RNAase灭菌水加至20 μL。 按以下参数进行荧光PCR扩增（具体扩增条件可根据实时荧光PCR检测试剂进行调整），42 ℃ 5 min，95 ℃ 10 sec，45个循环的 95 ℃ 5 sec，55 ℃ 34 sec，在每个55 ℃反应结束时收集荧光信号。 结果判定 阈值设定 阈值设定原则以阈值线刚好超过阴性对照扩增曲线的最高点，结果显示阴性为准。 质控标准 一般要求 检测结果中的阴、阳性对照均符合以下情况，如对照不成立，此次试验视为无效。 阴性对照 阴性对照无扩增曲线，或 Ct 值大于40。 阳性对照 阳性对照出现典型的扩增曲线呈 S 型，且 Ct 值小于或等于35。 结果判断 阳性判定：检测样本N亚基因组的 Ct 值小于或等于40，并有明显扩增曲线，则判定为亚基因阳性。 阴性判定：在对照成立下，如果检测样本N亚基因组没有出现扩增曲线，或 Ct 值大于40，则判定为亚基因阴性。 不确定结果：在对照成立下，如果检测样本N亚基因组扩增曲线不典型，结果不确定，建议重复检测。 （规范性附录）新型冠状病毒N亚基因组实时荧光PCR引物与探针序列及阳性对照片段序列 表A.1中给出了新型冠状病毒N亚基因组实时荧光PCR检测的引物与探针及阳性对照片段序列。 新型冠状病毒N亚基因组实时荧光PCR引物与探针序列及阳性对照片段序列 引物名称 引物序列(5to3) 长度（bp） nCov-SgRNA N-F ACCAACTTTCGATCTCTTGTAGA 23 nCov-SgRNA N-R TGAGGGTCCACCAAACGTA 19 nCov-SgRNA N-Probe CAGCGAAATGCACCCCGCA 19 阳性对照新型冠状病毒N亚基因片段 ACCTTCCCAGGTAACAAACCAA