蛋白质的提取与分离纯化生化实验设计讲解.pptxVIP

蛋白质的提取与分离纯化生化实验设计讲解; 已知某蛋白分子量约为17 kDa，等电点3.9~4.1，它能耐一定高温，在90 ?C加热3~4 min后依然能够保持80%活性。该蛋白含有较多疏水性残基，与Ca2+结合后能够暴露它疏水基团。该蛋白作用是作为生物体内酶激活剂。请设计一个从脑组织中提取和分离纯化该蛋白试验方案，要求写出详细步骤和理由，以及检测方法。;文件查得： 钙调蛋白（CaM）是由148个氨基酸组成单链分子,其pI值在3.9-4.1之间,分子量约为17KDa.该蛋白能够耐一定高温，在90oC加热3-4min后依然能够保持80%活性。该蛋白分子中含有较多疏水性残基，与Ca2+结合后能够暴露出它疏水基团。;整个试验过程普通可分为 5 个阶段： ①材料选择和预处理 ②细胞破碎（有时需进行细胞器分离）③提取 ④纯化（包含等电点沉降法，盐析，有机溶剂沉淀，吸附、层析、等）⑤分析判定。;一、材料选定：大鼠脑组织 预处理： 将切取组织用4℃预 冷0.01mol/lPBS漂洗去血渍，再用滤纸吸干残留PBS（磷酸盐缓冲液 ） 。;;;b、细胞器分离 ; 从破碎材料或细胞器提出蛋白质是不纯，需深入纯化。纯化包含将蛋白质与非蛋白质分开，将各种不一样蛋白质分开。选择提取条件时，就要考虑尽可能除去非蛋白质。普通总是有其它物质伴随混入提取液中。但有些杂质（如脂肪）以事先除去为宜。先除去便于以后操作。常见有机溶剂提取除去。 ;三、蛋白质粗提取 ;金属螯合亲和层析 ;值得注意是，在洗脱时，会有少许配基与蛋白质一同被洗脱下来，所以常在其后加一凝胶层析以除去小分子配基。 ;五、分析判定;当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质迁移率和分子量对数呈线性关系，符合下式： logMW=K-bX， 式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数若将已知分子量标准蛋白质迁移率对分子量对数作图，可取得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，依据它电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。 ;B、定量分析;谢谢观赏！