亲和层析完整版.ppt

 第一节　基本原理 生物分子能够区分结构与性质非常相近的其他分子，选择性地与其中某一分子相结合。生物分子间的这种特异性相互作用称为生物亲和作用，通过亲和作用发生的结合称为亲和结合。 利用生物分子间的这种特异性结合作用的原理进行生物物质分离纯化的技术称为分离纯化技术，其代表为亲和层析法。 技术要点： 亲和层析的特点： 一、基质（载体）的选择 载体在亲和层析中的作用是使配基固定化，同时提供了亲和对两物质特异性结合的空间环境。 1.理想的基质应满足下面的要求 纤维素 聚丙烯酰胺凝胶 聚丙烯酰胺－琼脂糖凝胶（ACA,Ultrogel） 交联葡聚糖 琼脂糖 交联琼脂糖　应用最多Sepharose 4B 多孔玻璃珠（CPG，Bio-Glass） 其它新型载体 * 重氮化法 ω-氨基烷基琼脂糖衍生物，对硝基苯甲酰氯反应，制得对硝基苯甲酰胺烷基琼脂糖衍生物。 用连二亚硫酸钠还原，亚硝酸钠处理，得重氮盐衍生物。 配基与重氮盐衍生物偶联，制得亲和层析柱。 * 碳二亚胺缩合法 碳二亚胺为羧基活化剂。 反应中的脲衍生物可用有机溶剂洗涤除去。 * （三）、用于固定化配基的凝胶衍生物 1、CNBr活化的Sepharose 4B Sepharose 4B经CNBr活化，可偶联蛋白和核酸类配基。 2、AH-Sepharose 4B和CH-Sepharose 4B 含有6个碳原子的”手臂”的琼脂糖衍生物 AH-Sepharose 4B用于含有羧基的一类配基。 CH-Sepharose 4B能与含有一级氨基的配基偶联。 * * 3、环氧活化型Sepharose 6B 由亲水“手臂”与Sepharose 6B载体通过醚链形成的衍生物。 用于小分子配基的固定化。 用于偶联脂多糖、蛋白等大分子配基。 * 4、活化型亲和胶10和15 由N-羟琥珀酰亚胺与琼脂糖衍生物形成的活化酯。 Affi-Gel10的“手臂”长为10个碳原子，产生一些负电荷，有利于碱性或中性蛋白偶联； Affi-Gel15为15个碳原子的“手臂”，产生一些正电荷，故有利于酸性蛋白的偶联。 * 5、CM-生物胶A、亲和胶202和亲和胶102 CM Bio-Gel A，无“手臂” 的羧基衍生物； Affi-Gel 102具有6个原子“手臂”，未端为氨基。 Affi-Gel202具有10个原子的“手臂”，未端具有羧基； * 四、 影响吸附亲和力的几个因素 KL 配基浓度对亲和力的影响 空间障碍的影响 配基与载体的结合位点的影响 载体孔径的影响 微环境的影响 * （一）、配基浓度对亲和力的影响 为将亲和配体与其它物质分开，需要阻留值≥10。 配基浓度与亲和对解离常数相关。 对于低亲和力系统，配基浓度。 * （二）、空间障碍的影响 空间位阻。 对于分子大的配体以及小分子配基更明显。 “手臂”，增加与载体相连配基的活动度，减轻载体的立体障碍。 常用的“手臂”多为烃链。 * （三）、配基与载体的结合位点的影响 多肽或蛋白质等大分子配基 须控制偶联反应条件，使它以最少的功能基团与载体连接。 保持蛋白质原有的高级结构，使亲和吸附剂具有较大的亲和力。 * （四）、载体孔径的影响 载体孔隙是配体向配基接近的通道。 孔径大小对吸附剂亲和能力有影响。 （五）、微环境的影响 载体及“手臂”的电性、极性对亲和力的影响。 避免引入离子键的基团。 疏水作用的存在，会引起非特异性吸附作用。 * 五、 亲和层析的吸附和洗脱 影响吸附的条件 亲和层析的洗脱 亲和吸附剂的再生 * （一）、影响吸附的条件 亲和吸附剂及配体的性质 缓冲液的种类、离子强度、pH、温度和层析流速有关。 温度升高会使吸附作用减弱。 流速每小时低于10 ml/cm2。 层析柱用前必须充分平衡。 上样体积为柱床体积的5%。 * 非专一性吸附 亲和层析中的非专一性吸附。 离子效应 疏水基团 复合亲和力 * 离子效应 配基与载体-间隔臂的不完全结合，将无关离子基团引入吸附剂。 具有离子基团的亲和吸附剂会影响蛋白质的洗脱行为。 * 疏水基团 吸附剂疏水性基团与蛋白质结构中的疏水区相互吸引，形成非专一性吸附。 疏水基团： （1）长的烃链结构的“手臂” （2）疏水性配基 * 复合亲和力 离子效应作用，又有疏水作用。 配体与配基有较强生物特异性。 用高浓度的盐和有机溶剂，以提高选择性。 * * 亲和层析 Affinity chromatography * 技术要点 （1）找与底物专一可逆结合的配基； （2）将配基通过共价键偶联到基质； （3）配基与底物吸附； （4）洗脱目标物。 寻找可与底物(S)专一可逆结合的配基; 将配基（L）通过共价键偶联到基质，并要求偶