DB37_T 3320-2018水貂、狐和貉常见细菌实时荧光PCR检测方法.pdf

ICS 65. 020. 30B41DB37山長东省地方标准DB37/T3320—2018水貂、狐和骆常见细菌实时荧光PCR检测方法Real-time fluorescent PCR for detecting of common bacterial pathogens of mink,foxand raccoon dog2018-06-12发布2018-07-12实施山东省质量技术监督局发布 DB37/T言本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草，本标准的附录为资料性附录。本标准由山东省畜牧兽医局提出。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准主要起草单位：山东省动物疫病预防与控制中心、山东大学生命科学学院。本标准主要起草人：王贵升、张鹤晓、王金宝、田夫林。I DB37/T 3320—2018水貂、狐和骆常见细菌实时荧光PCR检测方法1范围本标准规定了水貂、孤和骆常见细菌（大肠杆菌、绿脓杆菌、克雷伯氏菌、水气单胞菌、沙门氏菌、柠橡酸杆菌、不动杆菌）实时荧光PCR检测方法本标准所适用于水貂、狐和落的常见细菌的快速筛查和检测，其他动物细菌可参考本标准。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求GB/T 27401实验室质量控制规范动物检疫GB/T 6682分析实验室用水规格和实验方法3缩略语荧光定量PCR荧光定量聚合酶链式反应。Ct值每个反应管内的荧光信号量达到设定的阔值时所经历的循环圈数DNA脱氧核糖核酸。Taq酶Taq DNA聚合酵PBS磷酸盐缓冲生理盐水4试剂和材料4. 1灾光定量PCR检测仪及配套反应管（板）。4. 2高速台式冷冻离心机（离心速度12000r/min以上）4.3混匀器。4.4恒温水溶锅。4.5冰箱（2℃~8℃和-20℃两种）4.6微量移液器 (0.5 L~~10 L， 5 L~20 L， 20 L~~200 L，200 L~1 000 L及配套吸头4.71.5mL离心管（无核酸酶）4. 8可以选用经验证效果好的细菌DNA柱式提取试剂盒，或按照附录A配制试剂。样品的采集与前处理采样过程中样本不得交文污染，采样及样品前处理过程中须戴一次性手套。5.1取样工具 DB37/T 332020185. 1. 1棉拭子、剪刀、镊子、研钵、Eppendorf管。5.1.2所有上述取样工具必须经（121土2）℃，15min高压灭菌并烘干或经160℃干烤2h。5.2采样方法5. 2. 1拭子样品咽喉拭子采样，采样时要将拭子深入喉头及上聘来回刮3次5次，1取喉分泌波。肛拭子采样，采样时要将拭子深入肛门回刮3次～5次，取排漫物。5. 2. 2内脏或肌肉样品用无菌的剪刀和锻子剪取待检样品1.0g于研钵中充分研磨，再加5.0mLPBS混匀，然后将组织恐液转入无菌Eppendorf管中，编号备用。5. 2. 3血清或血浆用无菌注射器直接吸取至无菌Eppendorf管中，编号备用。5. 3运送与存放采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，尽快运送到实验室。采集或处理的样本在2℃～8℃条件下保存应不超过24h：若需长期保存，须放置-70℃C冰箱，但应避免反复冻融（最多冻融3次）。引物及探针见表1“荧光PCR方法的引物及探针”。表1荧光PCR方法的引物及探针GTG TGA TAT CTA CCC GCT TCG C大肠杆菌RAGA ACG GTT TGT GGT TAA TCA GGAProbeFAITCG GCA TCC GGT CAG TGG CAG TIGBFTGAAACGACCTGATTGCATTCGAT克雷伯氏菌RAGGCTGTCGGGATAAGCCAProbeHEX CGCGCCACYGGAAGGGYATGTAMRAACC CGARACG YAG GCT ATG绿胶杆菌RCAG GTC GGA GCT GTM CTA CTCProbeFAMAGGTGGTGATCGCACGCAGBHQFGCCATGCTGTTCGATGAT沙门氏菌RGTTACCGATAGCGGGAAAGGProbeFATTTTGCACCAC3IGCCAGCCCTAMRAFGCCGTCGAAACCAACGTAGA嗜水气单菌RCAACACCTGGTCCGGTATCGPFAMCAGCAGAAACTTGCCACTCGGTCTTG-BHQL不动杆菌FGTTGTGGCTTTAGGTTTATTATACGAAGTTACTCGACGCAATTCG2 DB37/T 3320—2018表1荧光PCR方法的引物及探针(续)不动杆菌ProbeCT5ACCCATCAAGGTAAAG