DB37_T 3673-2019牡蛎疱疹病毒І型检测技术规范 巢式PCR法.pdf

ICS11.220B 41DB37山 長东省地方标准DB 37/T 3673—2019牡蛎疱疹病毒1型检测技术规范巢式PCR法Ostreid herpesvirus-1 Detection Specification- Nested PCR2019-08-30发布2019-09-30实施山东省市场监督管理局发布 DB37/T次前1范围2规范性引用文件3术语和缩略语..3.1术语和定义3.2缩略语.4试剂及仪器4.1试剂4.2仪器5采样，5.1采样对象5.2采样数量、方法和保存运输5.3样品的采集6检测6.1DNA的提取.6.2巢式PCR操作步骤6.3电泳及测序7结果7.1结果判定7.2结果表述附录A（规范性附录）试剂及配制方法附录B（资料性附录）检测目的片段的DNA序列及电泳图 DB37/T言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由山东省农业农村厅提出并监督实施。本标准由山东省渔业标准化技术委员会（鲁TC03)归口。本标准起草单位：山东农业大学、济宁滨阳生物科技股份有限公司、泰安益海生物科技有限公司、泰安智博生物科技有限公司、南京根洋生物科技有限公司、南京少伯生物科技有限公司、南京福海生物科技有限公司。本标准起草人：王雪鹏、丁雷、闫现广、王方鹏、郭志明、孙永灿、付天增、姜衡、黄金菁。II DB37/T 3673—2019牡蛎疱疹病毒1型检测技术规范巢式PCR法1范围本标准规定了牡蛎疱疹病毒I型（0streidherpesvirus-1，0sHV-1）的巢式PCR检测方法，适用于对贝类样品进行疱参病毒型带毒情况的定性检测，以进行牡蛎疱渗病毒型的流行病学调查、诊断、检疫和监测。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法SC/T7205.1牡蛎包纳米虫病诊断规程3术语和缩略语3.1术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3. 1.1牡蛎疱疹病毒I型蛎疱病毒I型属于软体动物疱疹病毒科（Malacoherpesviridae）、牡蛎疱疹病毒属（Ostreavirus），是一种双链DNA病毒，在世界范围内广泛流行，主要危害牡蛎、扇贝和魁蜡等多种双壳贝类，对贝类养殖业造成重大的损害。3.2缩略语下列缩略语适用于本文件。bp:碱基对(base pair)dNTPs：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate）DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）EB：澳化乙啶（ethidiumbromide）EDTA:Z二胺四Z酸(ethylenediaminetetraacetic acid)PCR：聚合酵链式反应（polymerasechainreaction）Taq：水生栖热菌（thermusaquaticus）TE：Tris盐酸和EDTA缓冲液(EDTATris·HC1)Tris:三羟甲基氨基甲烷（tris hydroxymethyl aminomethane)试剂及仪器 DB37/T 3673—20194.1试剂4. 1. 1除非另有说明，实验用水均为GB/T6682规定的三级水或相当纯度的水，4. 1. 2无水乙醇：分析纯。4. 1. 3TE缓冲液按附录A.1的规定。4. 1. 4抽提缓冲液按附录A.2的规定。4. 1. 5蛋白酶K按附录A.3的规定。4. 1. 610mo1/L乙酸铵按附录A.4的规定。4. 1. 7Tirs饱和酚（pH≥7.8）：分析纯。4.1. 84. 1. 8酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)：分析纯。4. 1. 94. 1. 9氯仿/异戊醇(24：1)：分析纯，4. 1. 1050×TAE：见附录A5，也可以直接购买市售产品。4. 1. 111XTAE：见附录A.5。4. 1. 1270%乙醇按附录A.6的规定。4. 1. 13dNTP （各2.5 mmo1/L）：生化试剂，含dATP、dTTP、dGTP、dCTP各 2.5 mo1/L的混合物20C保存，用于PCR.4. 1. 1410×PCR反应缓冲液：见附录A7，也可以直接购买市售产品。4.1.15MgC1(25mmo1/L)：生化试剂，-20C保存。4. 1. 16Taq DNA聚合酶(5U/μL)：生化试剂，-20C保存4. 1. 17外引物CF：5”-ATTACCCAGATTCCCCTC-3”，20‘C保存。4.1. 18外引物 CR：5”CCACAAATGTAAACTGTGAC3