DB37_T 2842-2016鸭坦布苏病毒抗体间接酶联免疫吸附试验（ELISA）方法.pdf

ICS 11. 220B 41DB37山 長东省地方标准DB37/T2842—2016鸭坦布苏病毒抗体间接酶联免疫吸附试验(ELISA）方法An indirect ELISA for detection of specific antibody against Tembusu virus2016-09-18发布2016-10-18实施山东省质量技术监督局发布 DB37/T 2842—2016前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出。本标准由山东省畜牧业专业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东农业大学。本标准主要起草人：刁有祥、唐增、陈浩、冯强、提金风、高绪慧，I DB37/T 2842—2016鸭坦布苏病毒抗体间接酶联免疫吸附试验（ELISA）方法1范围本标准规定了鸭坦布苏病毒抗体间接酵联免疫吸附试验（ELISA）检测方法所需试剂及仪器、检测步骤、结果判定等。本标准所规定的鸭坦布苏病毒抗体间接酶联免疫吸附试验（ELISA）检测方法，适用于检测鸭血清中坦布苏病毒特异性抗体，2试剂及仪器2.1试剂2. 1. 1阳性血清，SPF鸭接种坦布苏病毒制备的血清。2. 1. 2阴性血清，SPF鸭血清。2. 1. 3坦布苏病毒抗原：原核表达的重组坦布苏病毒E蛋白。2. 1. 4酶标二抗：羊抗鸭辣根过氧化物酶标记的IgG。2. 1. 5磷酸盐缓冲液（PBS），见A.1。2. 1. 6包被液，见A.2.2. 1. 7洗涤液，见A.3.2. 1. 8样品稀释液（封闭液），见A.4.2. 1. 9底物溶液，商品化TMB底物显色液。2.1. 10终止液，见A.5。2. 2仪器2. 2. 1酶标仪。2. 2. 2微量加样器。2. 2. 3聚苯乙烯板。2. 2. 4水平振荡器。2. 2. 5恒温塔养箱。3样品准备3. 1待检鸭血清样品，每份不少于200μL，无溶血。3. 2被检血清样品用样品稀释液按1:40倍稀释，4操作步骤4. 1试验试剂预温到20C25C。 DB37/T 2842—20164.2将抗原按照浓度为2.6ng/叫用碳酸盐缓冲液稀释，每孔100加入到96孔聚苯乙烯板中，4C孵育过夜后，用洗涤液100μL洗板3次，每次置于水平振荡器300r/min震荡3min，甩干板上残余液体。4.3每孔加入200μL封闭液，37C温箱孵育1h，用4.2方法洗板。4.4在A1、A2孔各加100μL阴性血清对照，A3、A4孔各加100μL阳性血清对照4.5将待检血清样品加入其他各孔，每孔100μL，37℃温箱孵育1h，用4.2方法洗板。4.6酵标二抗用样品稀释液按1:500倍稀释，每孔加100μL，37℃孵有1h，用4.2方法洗板。4. 7每孔加100μL底物溶液，37C避光孵育15min。4. 8每孔加入50μL终止液，轻轻振荡，终止反应，4. 9置酶标仪于450nm测定各孔样品吸光度（0D）值，该操作需30min内完成。5结果判定5.1阴性对照OD均值等于（A1孔OD值+A2孔OD值）/2；阳性对照OD均值等于（A3孔OD值+A4孔OD 值)/2,5.2阳性对照平均值减去阴性对照平均值，其差必须大于0.40：阴性对照平均值必须小于等于0.20。试验条件成立，否则重做。5.3判定：5.3.1阳性样品0D450≥0.40，待检血清为阳性；即已感染坦布苏病毒。5. 3. 2阴性样品0D450≤0.20，待检血清为阴性；即未感染坦布苏病毒。5. 3. 3可疑样品0.200D4500.40，判为可疑，重新测定。2 DB37/T 2842—2016附录A（规范性附录）试剂配制磺酸盐缓冲液(PBS，0.01mo1/LpH7.4) NaC1308KC10. 2gKH,PO0. 2gNa,HP0,-12H;00. 2g蒸馏水加至1000 nL.A. 2包被液(0.055 mo1/L pH 9. 6)Na;COs0. 2756 gNaHCO,0. 6216 g蒸馏水加至100 ml.A. 3洗涤液PBS1000 mLTveen200. 5 ml.A. 4样品稀释液（封闭液）脱脂奶粉5. 0 g洗涤液100 ml.A. 5终止液H,S0, (98%)58 ml.蒸馏水442 ml.3