DB37_T 4038-2020鸡CpG寡脱氧核苷酸疫苗佐剂制备技术规程.pdf

ICS 11. 220B 41DB37山 長东省地電方标准DB37/T4038—2020鸡CpG寡脱氧核苷酸疫苗佐剂制备技术规程Preparation technique of CpG oligonucleotide adjuvant for chicken vaccines2020-07-09发布2020-08-09实施山东省市场监督管理局发布 DB37/T 4038—2020前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省农业科学院畜牧兽医研究所、齐鲁师范学院、山东润达检测技术有限公司。本标准主要起草人：张琳、吴家强、朱广伟、黄艳艳、于江、张玉玉、许传田、艾武、张秀美、刘军伟。I DB37/T 4038—2020鸡CpG寡脱氧核苷酸疫苗佐剂制备技术规程1范围本标准规定了鸡特异性CpG寡脱氧核苷酸疫苗佐剂的制备、检测、贮存等方面的技术规程。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682—2008分析实验室用水规格和试验方法3术语与定义下列术语和定义适用于本文件。3. 1CpG嘉脱氧核苷酸CpG oligonucleotide, CpG ODN含有未甲基化的CpG二核苷酸基序的核酸序列，能够在机体内诱导强烈的免疫反应。3. 2 硫代修饰phosphorthioate modified将核酸序列磷酸二酯键中的非桥氧原子置换成硫原子，主要用于防止反义实验中核酸被核酸酶降解。3. 3熔解温度meltingtemperature,Tm在DNA双螺旋结构热变性过程中紫外吸收值达到最大值的1/2时的温度，3. 4聚丙烯酰胺凝胶电泳polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对DNA片段进行分离，然后从凝胶中回收、纯化目的DNA。3. 5OD值optical density value表示被检测物吸收掉的光密度，是检测方法里的专有名词，检测单位用OD值表示。4试剂或材料 DB37/T 4038—2020除另有规定外，所用试剂均为分析纯4.1水：符合GB/T6682—2008一级水规定4.2三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸(TE)缓冲液：附录A.1.4.3生理盐水。4.4去内毒素质粒大提试剂盒，5仪器设备5. 1微量移液器：2.5uL、10 uL、200uL、1000uL。5. 2高速离心机：离心力13000转/分钟。5. 3无菌注射器：1ml、5mL.5. 4冰箱：低于-20℃。5.5紫外分光光度计：波长范围200nm～380nm5. 6超净工作台或生物安全柜。5. 7天平：精度0.1g5.8滤器：0.45um5.9恒温摇床：振荡频率10~400转/分钟，温度范围为室温70℃。6佐剂的制备6.1单链形态佐剂的制备鸡种属特异性CpG0DN序列：5-TCGTCGAACGTTCGAGATGAT-3’，全链或两端确代修饰，分子量6782.43g/nol，Tn值58.01.序列由生物公司合成，采用PAGE及以上纯化方式纯化，建议合成量200D/管，分装2管.6. 2双链形态佐剂的制备6.2.1重组质粒的构建6.2.1.1目的片段为含8拷贝鸡种属特异性CpG0DN序列（同6.1）的基因片段。目的片段5’端添加SaII酵切位点（gtcgac），3”端添加XhoI酶切位点（ctcgag），单拷贝序列间以碱基CTAGA连接。目的片段和原核表达质粒pET21a分别经Sa/1和XoI内切酶双酶切后，使用T4DNA连接酵进行重组连接。6. 2. 1. 22将重组质粒转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α中，在LB固体培养基（附录A.2）平板上37℃倒置培养约812小时后，挑取单克隆菌落至LB液体培养基（附录A.3）中，37℃条件下进行摇动过夜培养。6.2.2重组质粒的提取6.2.2.1用去内毒素质粒大提试剂盒进行重组质粒的提取。提取操作参照试剂盒说明书进行。6.2.2.2用0.45um的滤器过滤提取质粒，去除细菌、蛋白等杂质，纯净的双链重组质粒形态稳定，无需硫代修饰。7检测2 DB37/T 4038—20207. 1J单链形态合成产品取一支CpG0DN佐剂合成品（含100DCpGODN)放入高速离心机，12000转/分钟离心3～5分钟，加水5mL，溶解混勾后取100uL，加入光径为1cm的石英比色杯，然后加入900uL水，混勾后用紫外分光光度计测定260nm处的数值，如为0.2证明CpG0DN含量正常，如低于0.2说明CpG0DN含量过低，合成量不足