脊髓灰质炎病毒突变体荧光定量pcr方法的建立及验证.docxVIP

脊髓灰质炎病毒突变体荧光定量pcr方法的建立及验证 骨灰质炎病毒属于小核糖核酸病毒科。这三种血液（i、ii和iii）可引起骨灰质炎的发生。自1988年世界卫生组织启动“全球根除脊髓灰质炎行动”以来, 脊髓灰质炎病例数减少了99%以上;2013年, 世界上仅有尼日利亚、巴基斯坦和阿富汗3个国家仍然有脊髓灰质炎病毒的传播 目前, 脊髓灰质炎病毒神经毒力的检测方法主要包括猴体神经毒力试验、携带人脊髓灰质炎病毒受体的转基因小鼠 (PVR Tg21) 神经毒力试验、聚合酶链反应和限制性酶裂解突变分析 (mutant analysis by PCR and restriction enzyme cleavage, MAPREC) 以及深度测序 (deep sequence) 。上述方法的试验周期长, 费用高, 技术难度大, 对实验室硬件条件要求较高。Troy等 1 材料和方法 1.1 病毒和载体 脊髓灰质炎病毒Ⅰ型Sabin株、Ⅱ型Sabin株、Ⅲ型Pfizer株, 滴度分别为8.625、8.165和8.125 Lg CCID 1.2 dna检测和标准 WHO MAPREC type3国际标准品WHO 1st International Standard for MAPREC analysis of poliovirus type 3 (Sabin) DNA 0.9%472-C (NIBSC code:95/542) 和WHO 1st International Standard, Control DNA for MAPREC analysis of poliovirus type 3 (Sabin) (NIBSC code:94/790) 均购自英国国家生物制品检定所 (the National Institute for Biological Standards and Control, NIBSC) ;Taqman universal PCR master mix without UNG试剂盒、Mag MAX-96Viral RNA isolation kit试剂盒均购自美国Life Tech nologies公司;Prime script 1st c DNA synthesis kit、LA taq聚合酶均购自宝生物工程 (大连) 有限公司;Mag MAX 1.3 引物及探针的设计与合成 根据Gen Bank中登录的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒基因序列 (见表1) 和文献[2]设计引物及探针, 序列见表2, 引物探针均由Invitrogen公司合成。 1.4 质粒的构建 根据表1中的参考病毒信息, 委托宝生物工程 (大连) 有限公司合成6个脊髓灰质炎病毒5’UTR基因, 并克隆至p MD19-T载体。其中Sabin type 1、2、3病毒株为减毒株, 根据其基因序列合成并构建的质粒分别命名为非突变质粒P1-5’UTR、P2-5’UTR和P3-5’UTR;根据Poliovirus 1 strain Mahoney、Poliovirus 2 strain MEF-1和Poliovirus P3/Leon/37基因序列合成并构建的质粒分别命名为突变质粒P1REV-5’UTR、P2REV-5’UTR和P3REV-5’UTR。上述质粒送Invitrogen公司测序, 测序结果与参考序列进行比对。 1.5 病毒提取的提取 按照Mag MAX-96 Viral RNA isolation kit试剂盒说明书提取脊髓灰质炎病毒RNA。 1.6 病毒转移录 1.8 用于研究荧光定量pcr方法 1.8.1 琼脂糖凝胶电泳 分别以Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型突变质粒和非突变质粒为模板, 采用上述方法进行QPCR扩增, 产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。 由于针对同一型突变株和非突变株QPCR的引物仅有1~2个碱基的差异, 为判断该方法是否能够区分出突变和非突变模板, 采用突变QPCR或非突变QPCR反应同时检测突变质粒和非突变质粒, 分析Ct值之间的差异。 1.8.2 qpcr扩增条件 分别以10倍系列稀释的突变或非突变质粒为模板, 按1.7项方法进行突变QPCR扩增或非突变QPCR扩增。该试验在不同时间段重复3次, 通过计算Ct值间的变异系数 (CV) 验证QPCR方法的稳定性。 1.8.3 qpcr方法检测最低病毒量的测定 通过1.8.2项重复性验证结果确定突变QPCR扩增和非突变QPCR扩增检测质粒模板的灵敏度。将3次重复性试验均能成功扩增, 且Ct值间的CV小于15%的最小模板量确定为QPCR方法的灵敏度。 为验证QPCR方法能够检测到的最低病毒量, 将已知滴度的脊髓灰质炎病毒进行10倍系列稀释, 按照1.5和1.6项方法逆转录合成c DNA, 采用上述建立