DB37_T 3997-2020细菌耐药基因blaNDM常见亚型的环介导等温扩增检测技术.pdf

ICS 11. 220B 41DB37山 長东省地國方标准DB37/T3997—2020细菌耐药基因b/aNDM常见亚型的环介导等温扩增检测技术Loop-mediated isothermal amplification detection technique for common subtypes ofbacterial resistance gene blanDM2020-06-08发布2020-07-08实施山东省市场监督管理局发布 DB37/T 3997—2020前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准主要起草单位：山东省农业科学院畜牧兽医研究所、山东润达检测技术有限公司。本标准主要起草人：齐静、刘玉庆、杜以军、李璐璐、胡明、骆延波、张庆、张印、赵效南、任金瑞、刘军伟、王怀中、陶海英。I DB37/T 3997—2020细菌耐药基因b/a常见亚型的环介导等温扩增检测技术1范围本标准规定了细菌耐药基因blaw常见亚型（b/ae-1、b/ae-、b/ae-s和blae-）的环介导等温扩增LAMP（Loop-Mediated IsothermalAmplification）检测技术的操作步骤。本标准适用于实验室及临床样本的细菌耐药基因bl常见亚型（blan-1+bla-4、baa-和blaa-）的快速可视化检测，其他几个亚型的检测可以参考使用。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T 16489水质化物的测定亚甲基蓝分光光度法3试验原理本标准所应用的试验原理为：根据序列保守区域设计一对外引物、一对内引物和一对环引物特异性识别靶序列上六个独立区域，在BstDNA聚合酵的作用下引起自循环链置换反应，大量合成目标DNA的同时伴随有副产物焦磷酸镁白色沉淀产生，可以实现恒温扩增和快速检测，结果通过肉眼即可判定。4试剂或材料除非特别规定所用试剂均用分析纯水：符合国标GB/T6682一级水的规定。4.1Bst DNA 聚合酶。4.20.5XTBE缓冲液：配制见附录A.2。4.32%琼脂糖电泳液：配制见附求A.3。4.4无毒核酸染料。4.5 DNA Marker 2000。4.6商品化的细菌基因组DNA提取试剂盒。4.7引物：6Ia基因几个国内常见亚型的LAMP检测引物如下：外引物 F3:5”GGCCACACCAGTGACAAT3”:外引物 B3:5”GCGGAATGGTCATCACGAT3”:内引物 FIP:5’ACTTGGCCTTGCTGTCCTTGATGTTGGGATCGACGGCAC3′:内引物 BIP: 5′ CGCTCGGCAATCTCGGTGATGCTGGCCTTGGGGAACGC3” :—环引物 LF:5”GCTGTAGCGAAAACCACCG3”—环引物 LB：5”ACACTGAGCACTACGCCG3” DB37/T 3997—20205仪器设备5. 1微量移液器：10μL、20 μL、100 μL、1 000μL。5. 2低温高速离心机：离心力20000g5.3电热恒温水浴锅。5. 4稳流稳压电泳仪。5.5水平电泳槽，5. 6凝胶成像系统。5. 7电子分析天平：精度0.001g6试验步骤6. 1样品在生物安全柜中，将采集的样品（如人或动物的肛拭子、鼻拭子或肝脏、脾脏、脑等不同脏器组织等）无菌划线特异性筛选培养基或爵伦比亚血琼脂培养基，置37C培养箱过夜培养12h～18h，获得细菌单菌落，经二次纯化后，挑取单菌落于BHI营养肉汤中过夜培养12h～18h，用于提取细菌基因组DNA.6.2DNA的提取收集过夜培养的待检细菌菌液1mL（菌液浓度的0D值大于1.0）到1.5ml的EP管中，12000g离心2 min, 彻底弃上清，取沉淀用商品化的细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌基因组总DNA，最后溶于50μL灭菌水中，测定DNA的浓度，-20℃保存备用。6. 3反应体系反应体系见表1。表1环介导等温扩增LAMP反应体系2×等湿缓冲液(RM)12. 5 μL2外引物B3/F3(100 μ)0. 1 μL×2内引物 BIP/FIP (100 μM)0. 4 μL×24环引物 LF/LB (100 μM)0. 2 μL×22Bst DNA 聚合酶1. 0 μ L细菌基因组 DNA2. 0 μL灭菌水8. 1 μL其中：2×等温反应缓冲液RM[含有40 mMpH为8.8的Tris-HC1、20 mMKC1、16mMMgS0、20 mM(NHs)