6-6-氯-3-基-5-羟基己酸叔丁酯s-hoh的合成及应用.docxVIP

6-6-氯-3-基-5-羟基己酸叔丁酯s-hoh的合成及应用 tali活性物质是近年来开发的最成功的降血脂药物，在2016年的10家药物销售名单中占2%。 (S) -6-氯-3-羰基-5-羟基己酸叔丁酯[ (S) -CHOH]是他汀类药物的关键手性砌块, 可用于合成阿托伐他汀钙 (立普妥) 和瑞舒伐他汀钙 (可定) 等。 目前合成 (S) -CHOH的方法有很多, 其中氯酯路线已经实现了工业化 本研究从Lk TADH出发, 首先通过对其进行回复突变确定关键位点, 接着对关键位点进行饱和突变, 并对酶活提高的位点进行组合, 获得酶活最高的突变体M 1 材料和方法 1.1 质粒提取和合成 Prime STAR ue3ebMAX DNA Polymerase和Dpn I限制性内切核酸酶购自大连Ta KaRa公司。质粒DNA小量制备试剂盒, DNA凝胶回收试剂盒均购自杭州Axygen Biotechnology公司。卡那霉素 (kan) 和异丙基硫代-β-D-半乳糖苷 (IPTG) 购自北京鼎国生物技术有限责任公司。CDOH和 (S) -CHOH由本实验室合成 (后CDOH购自杭州杨德医药科技有限公司) 。其他试剂均为国产分析纯, 购自国药集团化学试剂有限公司。 1.2 dpni检验模板 设计含有突变氨基酸的PCR引物, 以p ET30-Lk TADH质粒为模板进行全质粒PCR, PCR产物经凝胶电泳分析后用Dpn I酶消化质粒模板, 消化产物直接转化E.coli BL21 (DE3) 感受态, 涂布于含有卡那霉素的抗性平板上, 过夜培养后挑取单菌落进行测序。 1.3 接种量的培养 将构建好的突变体在含有kan的LB固体平板上划出单菌落, 挑取单菌落接种于装有5ml含有50μg/ml kan的LB培养基中, 37℃、200r/min培养8h, 以2% (V/V) 的接种量转入50ml含有50μg/ml kan的LB培养基中, 37℃、200r/min培养2~3h至吸光度OD 1.4 不同浓度的cdhs反应 产物 (S) -CHOH的浓度检测采用HPLC方法。4 000r/min下离心15min, 收获菌体, 全细胞进行反应, 反应体系为1ml p H为5.5的柠檬酸-磷酸氢二钠-Na OH缓冲液, 10mmol/L的CDOH[预溶于50% (V) 异丙醇], 终浓度为1mmol/L的NADPH, 加入适量的细胞悬浮液后于金属浴中30℃、600r/min振荡反应20min, 反应液离心 (8 000r/min、5min) , 收集上清过滤后待HPLC检测 (每个反应做3个重复) (控制转化率在10%以内) 。 酶活单位 (U) 定义为:在所述条件下, 每分钟产生1μmol (S) -CHOH所需的酶量。酶活计算公式如下: 式中, X 1.5 突变酶的动态参数测定 反应体系为1ml, 在p H5.5柠檬酸-Na 采用Origin软件进行数据的曲线拟合计算出相应的动力学参数。 1.6 基于源研究和分子匹配 搜索蛋白质PDB数据库, 获得醇脱氢酶Lk ADH 2 结果讨论 2.1 返回突发模式确定的重要点 2.1.1 回复突变体的构建 为深入探究Lk TADH 4个突变位点对酶活的影响, 以p ET30-Lk TADH为模板进行回复突变, 构建一系列回复突变体 (表1) 。突变体全质粒PCR产物经琼脂糖核酸电泳分析结果如图2所示, 得到约6 200bp的目的条带, 大小与理论值相符, 同时序列测定结果也正确。 将构建好的突变体进行表达, 突变酶的表达情况基本一致, 如图3a所示, 典型突变体Lk TADH、M 2.1.2 关键因素的确定 如表2所示, 两点突变体M 基于上述分析比较, 选取突变体Lk TADH、M 2.2 重要点的饱和突变 为进一步提高酶活, 以M 2.3 多元动态分析 为深入研究突变点的作用机制, 以CDOH为底物分别测定了M 2.4 关于突变点的作用机制的分析 利用Discovery Studio以底物CDOH为配体, 以Lk TADH和M 3 结论 本研究从实验室菌株Lk TADH (M