基于转录组测序的菠萝蜜抗寒基因挖掘技术规范.pdfVIP

基于转录组测序的菠萝蜜抗寒基因挖掘技术规范 1 范围 本文件确立了基于转录组测序的菠萝蜜抗寒基因挖掘的试验方法、数据分析的标准。本标准主要 技术内容包括试验品种选择与使用、转录组测序流程 （RNA 提取、RNA 检测、文库构建、文库质检、 上机测序）、生物信息学分析 （测序数据及质量控制、转录本拼接、基因功能注释、CDS预测、基因 表达定量、差异基因筛选、差异表达基因功能注释和富集分析、转录因子注释）。 本标准适用于通过对不同耐寒性品种的菠萝蜜 （Artocarpus heterophyllus）进行转录组测序，筛选 菠萝蜜抗寒基因。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本 （包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 35890-2018 高通量测序数据序列格式规范 GB/T29859—2013 生物信息学术语 T/LTIA 18—2022 时空组学 时空转录组样本制备操作规范 T/CHIA 21.3—2021 组学样本处理与数据分析标准 第3部分：转录组样本处理 T/CHIA 21.4—2021 组学样本处理与数据分析标准 第4部分：转录组文库构建 T/CHIA 21.5—2021 组学样本处理与数据分析标准 第5部分：转录组测序数据分析 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 转录组测序 transcriptome sequencing 是通过二代测序平台快速全面地获得某一物种特定细胞或组织在某一状态下的几乎所有的转录本 及基因序列，可以用于研究基因表达量、基因功能、结构、可变剪接和新转录本预测等。 3.2 fastq格式 fastq是基于文本的、保存生物序列 （通常是核酸序列）和其测序质量信息的、每四行表示一条序列 的标准格式。[GB/T35890—2018，定义3.9] 3.3 质量控制 quality control 测序数据的质量好坏会影响数据的下游分析，质量控制指对测序仪下机的原始数据进行质量评估， 具体内容包括含N比例、GC含量、duplication情况、序列长度分布情况、碱基平衡情况等。 1 3.4 测序片段 reads 高通量测序平台产生的含有碱基序列和质量值的序列片段。 3.5 FPKMFragmentsPer Kilobaseoftranscriptper Million fragmentsmapped 每一百万个reads中map到外显子的每1000个reads上的fragment个数。 3.6 差异表达基因 differentially expressedgenes （DEGs） 通过阈值法、统计法或者其他检验方法，筛选出组间的表达水平存在显著差异的基因。 3.7 差异倍数 foldchange 根据同一个基因或转录本在不同条件下表达丰度差异的倍数。 3.8 基因本体论 geneontology （GO） 对基因和蛋白质功能进行限定和描述的语义词汇集合。[GB/T29859—2013，定义2.4.12] 3.9 KEGG分析 KyotoEncyclopediaofgenesandgenomes KEGG （京都基因与基因组百科全书）是基因组破译方面的数据库。KEGG分析为基因功能分析, 是指利用生物信息学和不同表达系统对基因的功能进行的预测、鉴定和验证。 4 原理 本项目利用RNA-seq 共完成两个菠萝蜜品系（6个样品）的转录组测序分析，共获得41.19Gb Clean Data，各样品Clean Data 均达到6Gb，Q30碱基百分比在92%及以上。基于组装结果，进行CDS预测； 基于比对结果，进行基因表达量分析。根据基因在不同样品中的表达量识别差异表达基因，并对其进行 功能注释和富集分析。同时筛选差异表达基因。 5 仪器设备及试剂 仪器：Illumina 高通量测序平台、琼脂糖凝胶电泳仪、NanoPhotometer 分光光度计、Qubit 2.0 荧光 计、Agilent 2100生物分析仪。 试剂：RNA 提取试剂盒 6 品种选择与使用 选取寒害后生长势一致的菠萝蜜广西本土耐寒品系(GXRZBLM00051，