DB22_T 1589-2012高粱品种鉴定 DNA指纹法（SSR）.pdf

ICS 65. 020B 05备案号：35077-2012DB22吉林省地國方标准DB22/梁品种鉴定DNA指纹法（SSR）Identification of sorghum (Sorghum bicolor (L.) Moench) varieties using DNAfingerprinting method (SSR)2012-09-15发布2012-10-31实施吉林省质量技术监督局发布 DB22/T 1589—2012用移液器吹吸加样槽，清除残胶和气泡，插入样品梳子，每一个加样孔点入4μL样品，70W恒功率电泳至上部的指示带（二甲苯青）达到胶板的中部（45min~50min）-电冰结束后，小心分开两块玻璃板，胶会紧贴在涂亲和硅烷的玻璃板上。9.4.1.7银染银染步骤如下：a)固定：将凝胶板置于装有固定液的塑料盒内，轻轻据荡10min；漂洗：双蒸水漂洗3min：c)染色：在新配染色液中，轻轻摇荡20min：d)漂洗：双蒸水漂洗，时间不超过10s：e)显彩影：在显影液申、轻轻据荡，直全出现带致：f)定彩：在固定液中定影2min：漂洗：用1.5L双蒸水漂洗2min：h）干胶：室湿下自然晾干。9.4.2DNA分析仪检测DNA分析仪检测的具体过程参照相对应仪器型号的操作说明书。10等位变异数据采集10.1数据表示样品每个SSR位点的等位变异采用扩增片段大小的形式表示。10.2数据采集10.2.1普通变性聚丙烯凝胶电泳数据采集片段大小即为待测样品该引物位点的等位变异大小，10.2.2DNA分析仪数据采集使用DNA分析仪的片段分析软件，读出每个位点每个样品的等位变异片段大小数据，通过使用参照品种，消除同型号不同批次间或不同型号DNA分析仪间可能存在的系统误差，比较参照品种的等位变异片段大小数据与附录B中的数据，如两者不一致，确定系统误差的大小。从待测样品的等位变异数据中去除该系统误差。10.3结果记录10.3.1普通变性聚丙烯既胺凝胶电泳结果记录将每个核心引物位点的所有谱带按扩增片段从小到大的顺序编号，用二位代码描述（依次为01、02），对照参照品种的谱带确定待测样品的基因型纯合位点的等位变异数据记录为X/X，其中X为该位点谱带的代码：杂合位点的等位变异数据记录为X/Y，其申X、Y为该位点上两个不同的谱带，小片段在前，大片段在后无效等位变异记承0/0。7 DB22/T 1589—2012示例1：以附录B中的引物Txp482为例，参照品种TX430在该核心引物位点上仅有一条谱带03，在该引物位点的增带代码记减为0303；示例2：以附录B中的引物Txp494为例，参照品种TX430在该核心引物位点上有两条谱带03和06，在该引物位点的谱带代码记录为0306.10.3.2DNA分析仪结果记录纯合位点的等位变异数据记承为X/X，其中X为该位点等位变异的大小；杂合位点的等位变异数据记录为X/Y，其中X，Y为该位点上两个不同的等位变异，小片段在前，大片段在后示例1：以附录B中的引物Txp482为例，多照品种TX430在该核心引物位点上有一个等位变异，大小为231bp，则该品种在该引物位点上的等位变异数据记求为231/231；示例2：以附录B中的引物Txp494为例，零照品种TX430在该核心引物位点上有两个等位变异，大小分别为203bp215bp，则该品种在该引物位点上的等位变异数据记承为203/215.11判定标准11.1直接比较11.1.1对两个或两个以上的品种同时进行检测时，先用附承A.1申20对基本核心引物检测，获得待测品种在这些引物位点的等位变异数据，利用这些数据进行品种间比较品种间差异位点数≥2，判定为不同品种，11.1.2对品种间差异位点数=0、1的情况，继续用附录A.2中20对扩展核心引物进行检测，利用全部引物位点的等位变异数据进行品种间比较：a)品种间差异位点数≥2，判定为不同品种：b)品种间差异位点数=1，判定为近似品种：品种间差异位点数三0，判定为就同品种对于b)和c)的情况，按GB/T19557.1的规定进行田间鉴定11.2数据库比较对待测品种进行检测后利用其检测数据和数据库中品种的数据进行比对时，先用附录A.1中20对基本核心引物检测，获得待测品种在上述引物位点的等位变异数据，利用这些数据和数据库中品种进行比较：品种间差异位点数2，判定为不同品种对品种间差异位点数=0、1的情况，将这些相近品种或疑同品种与待测品种按照11.1.2的方法进行鉴定.8 DB22/T 1589—2012附录A（规范性附录）引物清单表A.120对基本核心引物清单序号标记名称染色体正向引物（5-3’）反向引物（5°-3°）1Txp-4821018SATGTGTCCAGCATGCATAACTCATGTAGGGGCG